B淋巴细胞瘤-2关联永生基因3蛋白、多重肿瘤抑制基因1在宫颈癌癌前病变中表达及联合液基细胞学检查的临床意义

杜晓琴，马瑛，谢刚，陈丽娟，潘长清，张勇

作者单位：电子科技大学医学院附属绵阳医院·绵阳市中心医院妇产科，四川 绵阳 621000

宫颈癌是临床上一种常见的恶性肿瘤，流行病学研究提示［1］，近几年宫颈癌的发病年龄呈现显著的下降趋势，呈现显著的低龄化趋势，对于女性的生命安全以及生命质量造成严重的威胁［2］。目前已经证实［3］，机会性感染高危型人乳头状瘤病毒是造成宫颈癌的重要危险因素，随着病毒对病灶部位的不断侵染，病灶部位的病变逐步由癌前病变向肿瘤进行发展，所以早期对宫颈癌的癌前病变进行诊断，对于病人的预后具有积极的意义［4］。B 淋巴细胞瘤-2 关联永生基因3（BAG3）BAG 基因是肿瘤细胞凋亡的抑制性因素，该系列的基因对于多功能的结合蛋白的分泌功能的显著调节作用，进一步对肿瘤细胞的增殖周期进行调控［5］。多重肿瘤抑制基因1（P16）蛋白通过对肿瘤细胞周期蛋白D1 的特异性结合，进一步对肿瘤细胞的显著抑制［6］，阻碍肿瘤细胞的进展。本研究主要通过BAG3蛋白、P16在宫颈癌癌前病变病人中表达及联合液基细胞学检查的临床意义分析。

1 资料与方法

1.1 一般资料选择绵阳市中心医院2015 年6 月至2017 年6 月在妇科门诊筛查并经阴道镜宫颈活检确诊的120 例宫颈病变病人为研究对象，病人年龄（37.56±2.69）岁，根据其病变情况分为癌前病变组和宫颈癌组。其中，癌前病变组69 例，年龄（37.36±2.63）岁，身体质量指数（24.34±2.03）kg/m2，宫颈上皮内瘤变Ⅰ级（CINⅠ）15 例， CINⅡ 20 例、CINⅢ 34 例；宫颈癌组51 例，年龄（37.76±3.27）岁，体质量指数（24.76±2.24）kg/m2，宫颈癌的国际妇产科联盟FIGO 分期：Ⅰ~Ⅱ期23 例，Ⅲ~Ⅳ期28 例，病理类型：鳞癌34 例，腺癌17 例。两组年龄、身体质量指数等一般资料比较，差异无统计学意义（P>0.05），具有临床可比性。

病人或其近亲属对研究方案签署知情同意书。本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》相关要求。

宫颈癌病人的纳入标准：①均符合宫颈癌诊断标准［7］；②不存在其他原发性肿瘤；③病人的卡式评分均在60 分以上［8］。排除标准：①精神异常；②无法正常沟通；③哺乳期或妊娠期；④其他生殖系统疾病。癌前病变病人纳入标准：①经人乳头瘤病毒检查确诊为宫颈癌前病变；②出现白带异常、宫颈糜烂等表现；③性生活后有出血。

1.2 方法

1.2.1 样本采集所有检测指标均定期进行室间质控以及室内质控，保证检测指标的稳定性以及准确性。使用棉签于病人的宫颈口部位进行逆时针刮取采样，采样取3 次，停留时间为10 s，将样本置于细胞保存液的收集瓶中进行保存。

1.2.2 样本处理宫颈组织细胞样本经液基细胞学检测 采用液基薄层细胞自动制片机（新顺国际有限公司，Autocyteprep）对以上样本进行检测。将以上样本进行3 500 r/min 离心15 min 后，使用样本吸取机对样本进行混悬，随后使用比重液对病人的以上混悬液继续离心，使用样本吸取机对富集于试管底部的细胞进行收集，并在振荡器的作用下，重新使细胞处于混悬状态。将以上液体置于液基薄层细胞自动制片机中，在液基薄层细胞自动制片机进行巴氏染色，染色结束后，对以上玻片进行二甲苯处理后，保证玻片的湿润状态，使用中性树胶进行封固。

1.2.3 BAG3 蛋白、P16 水平检测将以上样本进行研磨后，采用二甲苯漂洗15 min，采用95%的乙醇进行漂洗2 次，漂洗时间设定为3 min，使用80%的乙醇溶液进行漂洗3 min，蒸馏水漂洗3 min，使用苏木精染色5 min，使用流水洗去染色，1%的盐酸乙醇洗涤3 s，蒸馏水洗3 s，使用80%的乙醇溶液进行漂洗3 s，使用95%的乙醇溶液进行漂洗3 s，使用100%的乙醇溶液进行漂洗3 s，中性树胶进行封片。将上述胶片使用过氧化物酶阻断溶液进行浸泡50µL，室温下孵育时间为10 min，使用磷酸缓冲盐溶液进行冲洗3 次，每次冲洗时间设定为3 min，去掉磷酸缓冲盐溶液后，再次对胶片进行正常非免疫动物血清进行室温孵育，孵育时间设定为10 min，再次去除血清后，使用BAG3、P16血清单抗进行检测，在400 倍显微镜下对病人的胶片进行观察，在观察过程中，取5 个视野，在每个视野对计数100 个肿瘤细胞，根据染色深度进行评价，没有染色为0 分，染色为淡黄色则为1 分，染色为棕黄色则为2 分，染色为黄褐色则为3分，阳性细胞的比例：病人的阳性细胞的比例在5%以下则为0分，阳性细胞的比例在5%~25%则为1 分，阳性细胞的比例在26%~50%则为2分，阳性细胞的比例在51%~75%则为3 分，阳性细胞的比例在76%~100%则为4 分，以染色情况以及阳性细胞的比例的乘积作为病人的BAG3、P16的表达量［9］。所有检测指标均定期进行室间质控以及室内质控，保证检测指标的稳定性以及准确性。

1.3 观察指标观察癌前病变组以及宫颈癌组BAG3、P16 水平。观察不同严重程度宫颈病变病人的BAG3、P16水平。CINⅠ为轻度非典型增生，细胞异型性低，排列不整齐，但仍保持极性，异常增生的宫颈细胞仅限于上皮层的下1/3；CINⅡ为中度非典型增生，细胞异型性较为明显，排列紊乱，异常增生的宫颈细胞占上皮层的下2/3；CINⅢ为重度非典型增生，细胞异型性明显，极性消失，异常增生的宫颈细胞占上皮层的下2/3以上。

1.4 统计学方法数据分析采用SPSS 23.0 进行，正态分布的计量资料以表示，两组间比较采用独立样本t检验比较，三组间比较采用单因素方差分析，进一步组间两两比较采用SNK-q检验，BAG3、P16 水平与液基细胞学检查的联合检测对宫颈癌癌前病变的诊断效能进行分析，分别计算灵敏度、特异度、符合率、阳性预测值和阴性预测值，宫颈癌癌前病变诊断效能评价采用受试者操作特征曲线（ROC 曲线），曲线下面积（AUC）比较采用Z检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组BAG3、P16 水平比较宫颈癌组BAG3、P16 水平显著高于癌前病变组，差异有统计学意义。见表1。

表1 宫颈病变120例B淋巴细胞瘤-2关联永生基因3（BAG3）蛋白、多重肿瘤抑制基因1（P16）水平比较/

表1 宫颈病变120例B淋巴细胞瘤-2关联永生基因3（BAG3）蛋白、多重肿瘤抑制基因1（P16）水平比较/

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2.2 不同严重程度宫颈癌癌前病变病人的BAG3、P16水平比较不同严重程度宫颈癌癌前病变病人的BAG3、P16 水平之间的差异有统计学意义，经两两比较，病人的BAG3、P16 水平从低到高为CINⅠ组、CINⅡ组、CINⅢ组。见表2。

表2 不同程度宫颈癌癌前病变B淋巴细胞瘤-2关联永生基因3（BAG3）蛋白、多重肿瘤抑制基因1（P16）比较/

表2 不同程度宫颈癌癌前病变B淋巴细胞瘤-2关联永生基因3（BAG3）蛋白、多重肿瘤抑制基因1（P16）比较/

注：①与CINⅠ组比较，P<0.05。②与CINⅡ组比较，P<0.05。

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2.3 联合检测效能分析联合诊断对于宫颈癌癌前病变的诊断特异度、准确率、阳性预测值、阴性预测值均显著高于单独检测（P<0.05）。见表3。

表3 联合检测效能分析

2.4 ROC 曲线分析通过ROC 曲线分析结果发现联合检测对于宫颈癌癌前病变的诊断ROC 曲线下面积显著高于单独检测，联合诊断与 BAG3 比较，Z=4.13，P<0.001；联合诊断与 P16 比较，Z=3.76，P=0.008；联合诊断与液基比较，Z=3.03，P=0.022。见表4。

表4 联合检测对于宫颈癌癌前病变的诊断ROC曲线分析

3 讨论

宫颈癌是临床较为常见的女性恶性肿瘤之一，流行病学调查显示［10］，我国每年的新发宫颈癌的病例在13 万以上，其中死亡病例在3 万以上，其发病率以及死亡率呈现逐年上升的趋势，同时从年龄的构成上比较，宫颈癌病人的年龄呈现显著的年轻化趋势。在宫颈癌疾病的进展中，疾病的进展较为缓慢，具有明显的癌前病变特征［11］，所以在临床诊断中，通过对病人的特异性诊断，显著提升宫颈癌以及宫颈癌前病变的诊断准确性，对于临床早期开展干预具有积极的意义。而在常规的诊断中，通常采取液基细胞学检查，但是已有报道［12］指出，其对宫颈癌的癌前病变的诊断具有一定的局限性，所以在临床诊断中，通过多种灵敏度较高的指标诊断，对于提升对癌前病变的诊断具有积极的意义［13］。P16蛋白由肿瘤抑制基因CDKN2A 在9 号染色体编码，作用是细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂，P16INK4a的过度表达可作为一个致癌型HPV 病毒破坏细胞周期的替代标志物，所以在机体的病变组织的分析中，随着机体的P16蛋白被特异性受体的结合，病人的P16 呈现下降的趋势［14］。随着机体P16 水平的下降，机体的肿瘤细胞增殖周期显著激活，对于肿瘤细胞的进一步浸染具有重要作用［15］。以往的研究已经证实，虽然P16INK4a 弥漫的染色主要与CINⅡ（75.5%~100%）和CINⅢ（100%）有关，然而值得注意的是，大约50%以上的CINⅠ也有强的P16INK4a表达［12］。但是单独通过对病人的P16表达水平的检测，并不能对病人的疾病进展进行诊断，需要与多种指标的联合诊断，以期提高对宫颈癌的诊断效能。刘峰等［13］通过对宫颈癌病人的P16 水平的分析，病人的P16 水平显著上升，与本研究结果一致。BAG3 蛋白广泛存在于肿瘤细胞中，在肿瘤进展中起着重要作用，研究［14-17］表明，宫颈癌病人的疾病进展以及疾病的复发与机体的BAG3 蛋白呈现显著的相关性，在长期的随访分析中，较高BAG3 蛋白表达水平是病人的良好预后的重要指标。

另外，通过对联合检测效能的分析，联合诊断对于宫颈癌的诊断效能显著高于单独检测，提示，通过对肿瘤细胞增殖周期的预测，联合对肿瘤细胞的形态学的研究，可显著提升宫颈癌癌前病变的诊断效能。但本研究还存在一定的局限性，由于纳入样本量较低，有待在日后研究中进行大样本研究。

综上所述，随着宫颈癌前病变的进展，P16、BAG3表达增加，BAG3蛋白、P16联合液基细胞学检查对于病人的诊断具有积极的意义。