腹腔注射α-半乳糖苷神经酰胺对小鼠肺恒定自然杀伤T细胞及亚群的影响

彭楠，张景楠，陈俊玉，滕景芳，孟明，曹彩霞，王彦

作者单位：1河北大学临床医学院、河北大学附属医院检验科，河北 保定 071000；

2河北大学基础医学院，河北 保定 071000；

3保定市中心血站，河北 保定 071000

恒定自然杀伤T 细胞（invariant nature kiler T cell，iNKT）是T 淋巴细胞中一个独特的亚群，可识别 CD1d 分子呈递的脂类抗原。活化后分泌多种细胞因子，直接或间接参与各项机体免疫反应［1］。iNKT 细胞在胸腺中分化成不同的亚群，包括iNKT1［主要分泌干扰素-γ（IFN-γ）］、iNKT2［主要分泌白细胞介素-4（IL-4）］、iNKT17［主要分泌白细胞介素-17A（IL-17A）］［2］。最新研究证明，特异性激活iNKT 细胞亚群，可以更有效地发挥其免疫调节和治疗的作用，在感染、肿瘤等疾病中，我们希望iNKT细胞产生促炎性因子的作用，而在自身免疫性疾病时，我们更希望激活iNKT 细胞的抗炎性免疫反应［3-4］。α-半乳糖苷神经酰胺（α-GalCer ）是iNKT 细胞特异性激活剂，是已知的最有效的iNKT细胞选择性抗原［5］。但是大剂量的α-GalCer 刺激，会使iNKT细胞在数月内进入免疫失能状态，对后续的抗原刺激反应减弱或无应答［6］。

在小鼠肺中，iNKT 细胞在肺脉管系统和间质组织间建立了非循环群体［7］。大多数 iNKT1 和iNKT2细胞存在于脉管系统中，iNKT17 细胞主要存在于组织间质［8-9］。呼吸系统的免疫系统承受着巨大的负荷和种类繁多的外来抗原，引发多种免疫反应［10］。因此研究腹腔注射α-GalCer对小鼠肺iNKT细胞、细胞亚群及外周血细胞因子的影响，观察其动态变化，从而为后续获得临床免疫细胞治疗提供基础研究数据，同时也可为疫苗的研发提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物6~8 周龄的雄性C57BL/6J 小鼠，引入SPF 级动物室后，进行1周适应性饲养，随后进行实验。该实验已通过河北大学动物福利伦理委员会的批准且在操作过程中严格遵守《实验动物保护条例》。

1.1.2 主要试剂与仪器α-GalCer（北京Adipo⁃Gen）；戊巴比妥钠、小鼠组织淋巴细胞分离液、0.5 mol/L EDTA（北京索莱宝）；Foxp3/Transcription Fac⁃tor Staining Buffer（美国Invitrogen）；FITC Hamster Anti-Mouse TCR-β Chain、AlexaFluor®647-mouse an⁃ti-PLZF、BV421 Mouse Anti-Mouse RORγt 、PE-Cy™7 Mouse Anti-T-bet（美国BD）；T-selected-CD1d tetra⁃mer-PE（日本MBL）；Mouse-IFN-γ ELISA、Mouse-IL-4 ELISA、Mouse-IL-17A ELISA（联科生物，杭州）。Olympus-Ⅱ光学显微镜（日本，Olympus）；流式细胞仪FACSCantoII（美国，BD Pharmingen ）；酶标仪（美国，Bio-tek EPOCH）；低温高速离心机（美国，Beck⁃man公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 小鼠模型制备及干预C57BL/6 小鼠，雄性，每只体质量（20±2）g，采用随机数字表法分为正常对照组和α-GalCer 干预组，每组30 只，α-GalCer 干预组每克体质量注射α-GalCer 100 ng，正常对照组注射同等体积的生理盐水。于小鼠腹腔注射α-Gal⁃cer 2、4、6、8、10 d 后，检测各组小鼠肺内iNKT 细胞及亚群的变化；在2、6、8 d 后检测小鼠外周血细胞因子的变化。

1.2.2 标本的获取与处理腹腔注射1%的苯巴比妥钠盐（50 mg/kg）对小鼠麻醉后进行眼球取血，12 000 r/min，4 ℃离心8 min，收集上清转至EP 管中，−80 ℃冰箱低温保存用于ELISA 检测。随后脱颈椎处死小鼠，用外科剪及镊子获取小鼠的肺组织，小鼠肺脏于浸润冰PBS缓冲液的细胞筛上剪碎、研磨获取单细胞悬液。细胞经PBS 洗涤离心2 次，1 000 r/min，4 ℃离心5 min 获取细胞沉淀。重悬后过淋巴细胞分离液，再次经PBS 洗涤离心2 次，弃上清后获取单细胞悬液。

1.2.3 小鼠外周血血清细胞因子的检测提前将试剂及样本平衡至室温并确定所需的酶标板孔数，按照ELISA 试剂盒说明书规范操作，检测小鼠血清IFN-γ、IL-4和IL-17A 的表达水平。

1.2.4 肺淋巴细胞中iNKT 频率检测收集“1.2.2”获取的单细胞悬液于流式管中，每管106个细胞，加入1 µL FITC Hamster Anti-Mouse TCR-β Chain 和1µL PE 标记的负载α-GalCer 的CD1d 四聚体（PE-α-GalCer/CD1d-tetramer），涡旋混匀4 ℃避光孵育30 min，PBS清洗2次后用500 µL 4 ℃的PBS重悬细胞，吹打混匀经流式细胞仪检测iNKT（TCR-β+α-GalCer/CD1d-tetramer+）细胞频率。α-GalCer/CD1d-tetramer为本实验室配制：采用体积分数为0.5%的吐温−20 和质量分数为0.9%的生理盐水将浓度为1 g/L的α-GalCer 贮存液稀释至200 mg/L，随后将5 µL 稀释液加入到100 µL CD1d-tetramer 中，混匀，室温过夜负载18~20 h后于4 ℃储存备用。

1.2.5 肺iNKT1、iNKT2、iNKT17 亚群频率检测同上述1.2.4 小节所述，加入FITC Hamster Anti-Mouse TCR-β Chain 和PE-α-GalCer/CD1d-tetramer 对分离的淋巴细胞进行表染，PBS 清洗2 次后，按照Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer 试剂盒说明书对细胞进行透化固定处理，进行亚群检测。每支流式管中加入1 mL 透化固定液于4 ℃避光透化固定45 min；加入1 mL 1×破膜缓冲液使偶联荧光素的抗体充分进入细胞，500g，4 ℃离心5 min；弃上清后加入AlexaFluor®647-mouse anti-PLZF、BV421 Mouse Anti-Mouse RORγt、PE/Cyanine7 Mouse Anti-T-bet 各1µL，吹打混匀后4 ℃避光孵育30 min，每管加入1×破膜缓冲液1 mL，500g，4 ℃离心5 min。弃上清后用500 µL 4 ℃的PBS 重悬细胞，吹打混匀后上机检测iNKT 细胞亚群频率。在淋巴细胞群中以TCR-β+α-GalCer/CD1d-tetramer+双阳性细胞群为iNKT 细胞。在iNKT 细胞群中，以T-bet+PLZF-为iNKT1 亚群，T-bet-PLZF+为iNKT2 亚群，RORγt+PLZF-为iNKT17亚群。

1.3 统计学方法所有数据应用SPSS 24.0 进行统计学分析，计量数据以表示，两组不同时间点之间比较采用重复测量数据方差分析，同组内不同时间点的两两比较采用LSD-t检验，P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠肺脏iNKT细胞频率及亚群的变化

2.1.1 iNKT 细胞频率重复测量数据的方差分析结果显示，组别因素（F=12.61，P<0.001）和时间因素（F=233.41，P<0.001）对iNKT 细胞频率均有影响，且两者之间存在交互作用（F=195.53，P<0.001）。组内分析结果显示，对照组iNKT细胞频率在各时间点差异无统计学意义；α-GalCer干预组iNKT 细胞频率在第4、6、8、10 天明显时明显低于第2 天（P<0.05）；组间分析结果显示，α-GalCer干预组iNKT 细胞频率在第2 天时高于对照组，第6、8、10 天时低于对照组（P<0.05）。见表1。

表1 小鼠肺脏恒定自然杀伤T细胞频率变化/（%，）

表1 小鼠肺脏恒定自然杀伤T细胞频率变化/（%，）

注：①与第2天相比，P<0.05。②与对照组相比，P<0.05。

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2.1.2 iNKT1亚群细胞频率重复测量数据的方差分析结果显示，组别因素（F=176.04，P<0.001）和时间因素（F=16.41，P<0.001）对iNKT1 亚群细胞频率均有影响，且两者之间存在交互作用（F=19.70，P<0.001）。组内分析结果显示，对照组iNKT1 亚群细胞频率在各时间点差异无统计学意义；α-GalCer 干预组iNKT1 细胞频率在第4、6、8、10 天明显时明显低于第2 天（P<0.05）；组间分析结果显示，α-GalCer干预组iNKT1 亚群细胞频率在第2、4、6、8、10 天时均低于对照组（P<0.05）。见表2。

表2 小鼠肺脏恒定自然杀伤T细胞1亚群细胞频率变化/（%，）

表2 小鼠肺脏恒定自然杀伤T细胞1亚群细胞频率变化/（%，）

注：①与第2天相比，P<0.05。②与对照组相比，P<0.05。

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2.1.3 iNKT2亚群细胞频率重复测量数据的方差分析结果显示，组别因素（F=108.13，P<0.001）和时间因素（F=92.97，P<0.001）对iNKT2 细胞频率均有影响，且两者之间存在交互作用（F=92.93，P<0.001）。组内分析结果显示，对照组iNKT2 细胞频率在各时间点差异无统计学意义；α-GalCer 干预组iNKT 细胞频率在第4、6、8、10 天明显时明显高于第2 天（P<0.05）；组间分析结果显示，α-GalCer 干预组iNKT 细胞频率在第2、4、6、8、10 天时均高于对照组（P<0.05）。见表3。

表3 小鼠肺脏恒定自然杀伤T细胞2亚群细胞频率变化/（%，）

表3 小鼠肺脏恒定自然杀伤T细胞2亚群细胞频率变化/（%，）

注：①与第2天相比，P<0.05。②与对照组相比，P<0.05。

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2.1.4 iNKT17 亚群细胞频率重复测量数据的方差分析结果显示，组别因素（F=8.21，P=0.001）和时间因素（F=43.29，P<0.001）对iNKT17 细胞频率均有影响，且两者之间存在交互作用（F=38.72，P<0.001）。组内分析结果显示，对照组iNKT17 细胞频率在各时间点的差异不大；α-GalCer干预组iNKT 细胞频率在第4、6、8、10 天明显时明显高第2 天（P<0.05）；组间分析结果显示α-GalCer 干预组iNKT 细胞频率在第2 天时均低于对照组，第4、8 天高于对照组（P<0.05）。见表4。

表4 小鼠肺脏恒定自然杀伤T细胞17亚群细胞频率变化/（%，）

表4 小鼠肺脏恒定自然杀伤T细胞17亚群细胞频率变化/（%，）

注：①与第2天相比，P<0.05。②与对照组相比，P<0.05。

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2.2 腹腔注射α-GalCer 后不同时间引发血清中细胞因子的变化重复测量数据的方差分析结果显示，组别因素（F=95.95、10.29、64.29，P<0.001、0.003、<0.001）和时间因素（F=546.35、6.33、14.87，P<0.001、0.006、<0.001）对IFN-γ、IL-4、IL-17A 水平均有影响，且两者之间存在交互作用（F=5.87、26.68、3.43，P=0.007、<0.001、0.046）。组内分析结果显示，对照组第6 天和第8 天的IFN-γ 水平低于第2 天，第6天的IL-4水平高于第2天，第6天的IL-17A 水平低于第2 天；α-GalCer 干预组第6 天和第8 天的IFN-γ和IL-4 水平低于第2 天，第6 天的IL-17A 水平低于第2 天；均差异有统计学意义（P<0.05）。组间分析结果显示α-GalCer 干预组在第2 天时IFN-γ 和IL-4水平高于对照组，IL-17A 水平低于对照组；在第6天时IFN-γ 水平高于对照组，IL-4 和IL-17A 水平低于对照组；在第8 天时IFN-γ 水平高于对照组，IL-17A水平低于对照组；上述均差异有统计学意义（P<0.05）。见表5。

表5 小鼠腹腔注射 α-GalCer后血清中细胞因子变化统计/（ng/L，）

表5 小鼠腹腔注射 α-GalCer后血清中细胞因子变化统计/（ng/L，）

注：α-GalCer为α-半乳糖苷神经酰胺，IFN-γ为干扰素-γ，IL-4为白细胞介素-4，IL-17A为白细胞介素-17A。①与第2天相比，P<0.05。②与对照组相比，P<0.05。

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3 讨论

iNKT 细胞是连接先天性与适应性免疫反应的桥梁，其恒定的T 细胞受体识别MHC-Ⅰ类分子CD1d 呈递的糖脂类抗原，从而导致细胞因子达到“爆炸性”效应反应［11］。微环境的改变也可以调节肺中iNKT 细胞稳态［12］。iNKT 细胞活化后可分泌Th1型促炎（如IFN-γ）或Th2型抑炎细胞因子（IL-4）［13］。iNKT 细胞在肺组织中虽远不如在肝脏中丰富，但其确实对于某些肺部疾病产生了深远影响。例如iNKT 细胞反应迅速，因此在对呼吸道感染的反应中发挥关键作用［12］；有研究［14］表明iNKT细胞在介导气道高反应性（AHR）中发挥作用。

α-GalCer 能够与抗原提呈细胞表面CD1d 分子结合，提呈给iNKT 细胞表面的TCR 受体，从而激活iNKT 细胞，发挥致炎或抑炎作用，有文章［15-16］报道，腹腔注射抗原最容易被巨噬细胞所提呈。

研究［16］表明不同的组织中富含不同的 iNKT 细胞亚群，例如，在小鼠肝脏中iNKT1细胞亚群占主导地位，而iNKT17 细胞主要位于肺、淋巴结和皮肤中。iNKT2 细胞分布在肺和脾几个部位，但它们在肠系膜淋巴结中的含量更为丰富［2］。本项研究数据中显示，小鼠肺脏iNKT1 多于iNKT2，推测原因可能是由于腹腔注射过程中，药物导致小鼠肺脏中微生物群发生改变［12］，具体原因还有待进一步探查。

有研究［17］表明，在基础条件下的肺中，iNKT 细胞主要存在于脉管系统中，而一小部分存在于间质中，我们与其所得结果结论一致，腹腔注射α-GalCer后，间质中iNKT17 亚群频率随时间而升高，脉管系统中的iNKT1 亚群频率明显降低，说明在注入激活剂后，肺iNKT 细胞迁出脉管系统而进入间质，这种行为有着有着很强的特异性。

通过对小鼠不同时间的动态观察，我们可以发现，小鼠肺脏中iNKT 细胞频率呈现前期（2 d）升高，后期降低的趋势，我们推测是由于注射α-GalCer 2 d 后再取材检测，已经错过了小鼠体内肺iNKT 细胞频率达到最大的时间，从而后续时间内，iNKT 细胞频率一直降低；小鼠肺脏中iNKT1 亚群频率在腹腔注射α-GalCer 后一直处于下降的趋势，其中第8天达到最低值（1.88±0.25）%，这可能是由于肺部的微环境限制了iNKT1 细胞亚群的增殖，或者已经增殖的iNKT1 细胞迁至外周所致［11］；小鼠肺脏中iNKT2 亚群频率一直处于上升的趋势，其中第4 天达到最高值（21.83±0.61）%，这可能是由于正常机体内iNKT1与iNKT2是一种平衡关系，二者此消彼长，当iNKT1 亚群频率受到明显抑制时，在α-GalCer 的刺激下，iNKT2 增长，维持机体的健康；小鼠肺脏中iNKT17 亚群频率升高，文章表明β-连环蛋白调节iNKT 细胞分化为 iNKT2 和 iNKT17［18］。因此，可以在一定程度上说明两种亚群有一定的相关性，对肺部炎症可以产生一定的影响。

iNKT 细胞的免疫调节作用依赖于细胞因子的分泌，因此我们也做了相应小鼠外周血细胞因子的变化统计试验，腹腔注射α-GalCer 后，IFN-γ 浓度一直处于上升的趋势，其中，第2 天升高最明显（500.45±7.68）ng/L，IFN-γ 主要是由iNKT1细胞产生的Th1 型细胞因子，因此我们推测，腹腔注射α-Gal⁃cer 以升高小鼠体内iNKT1 亚群为主，已有研究报道，IFN-γ 会抑制外周血IL-4 的释放［16］，但本研究显示，第2 天IFN-γ 与IL-2 均呈升高趋势，推测原因可能与腹腔注射α-GalCer 可以导致小鼠外周血中IL-10 水平增高有关［19］。IL-17A 被认为是炎症反应的重要调节因子，研究表明小鼠注射α-GalCer 后会导致IL-17A 快速而稳定地释放到血液中［20］，而研究数据显示IL-17A含量下降，其原因有待进一步研究。

综上所述，腹腔注射α-GalCer 可以对肺部iNKT细胞及亚群的激活可以产生不同影响。iNKT 细胞不同亚群发挥的免疫调节与免疫治疗作用是不同的，做此项研究可以为日后肺部相关疾病的细胞治疗提供基础性研究数据。同时外周血细胞因子的变化也进一步提示了腹腔注射α-GalCer 会影响机体的免疫功能。