苍术内酯对骨关节炎大鼠软骨损伤修复和软骨细胞凋亡的影响

郭跃生，穆岭，张锟，赵大伟，姚太顺

作者单位：洛阳正骨医院（河南省骨科医院）足踝一科，河南 洛阳 471002

骨关节炎（osteoarthritis， OA）为中老年人常见病症，是一种慢性退行性关节疾病，其发病率随着年龄增长而升高，70 岁以上的老人患病率高达70%［1］。临床病理表现主要为关节肿痛、关节软骨退化或缺失、关节活动僵硬等，严重影响病人日常生活［2］。软骨组织靠关节液进行物质交换，一旦受到损伤，靠自身代谢修复组织功能十分困难［4］。OA发病机制复杂，目前临床仍为保守治疗，迫切需要寻找更加安全有效的药物。苍术内酯（atractyleno⁃lide， AT）是分离自中草药白术的一种生物活性成分，具有良好的抗炎止痛、祛风散寒药理作用，中医学临床中常用于治疗风湿和消化系统疾病［5］。研究表明，AT 可以调节炎性因子水平，对细胞增殖和凋亡亦有影响，推测其或对软骨损伤有积极作用［6］。因此，本研究自2022 年1―4 月建立OA 大鼠模型，探讨AT 对软骨损伤的影响，并分析其可能作用机制，旨在为临床提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物SPF 级SD 大鼠，雄性，60 只，7~8周龄，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号：SCXK（京）2016-0011。体质量210~230 g。饲养条件设置为：环境温度为20~24 ℃，保持良好通风，给予充足饮水和普通饲料，适应性饲养1周。

1.1.2 药品、主要试剂和仪器AT（纯度≥98%，上海沪峥生物科技有限公司，批号HZ-22023）；肿瘤坏死因子-α（tumour necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素-1β（interleukin-1β， IL-1β）、白细胞介素-6（in⁃terleukin-6， IL-6）ELISA 试剂盒（北京雅安达生物科技有限公司）；兔抗β-actin 多克隆抗体、高迁移率族蛋白2（high mobility group proteins，HMGA2）、糖原合成酶激酶-3β（glycogen synthetase kinase，GSK-3β）、凋亡蛋白B 细胞淋巴瘤因子2（Bcl-2）、Bcl-2 相关蛋白（bcl-2 related x protein， Bax）多克隆抗体、山羊抗兔二抗IgG（北京索莱宝科技有限公司）；小动物手术器械（南京赛博生物技术有限公司）；石蜡包埋机（徕卡-2018型，赛默飞世尔仪器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 OA 大鼠模型建立采用前后交叉韧带断离术建立OA模型，选取48只大鼠腹腔注射3%戊巴比妥钠进行麻醉后，固定于手术台上，将大鼠左后腿毛剃除并消毒，无菌条件下在左侧膝关节髌内纵向切开皮肤，暴露出整个膝关节，止血钳钝性分离结缔组织、血管、肌肉等，显露前交叉韧带横向剪断，切除1/3 半月板，保留关节软骨面，逐层缝合。手术完毕给各组大鼠腹腔注射青霉素，预防感染。术后3 d 内，每日将大鼠放入跑步笼中30 min，观察大鼠状态，大鼠出现膝关节肿胀变形，走路跛行或侧倒，视为建模成功［7］。

1.2.2 分组与给药造模成功大鼠随机分为模型组、AT 低、中、高剂量组，各12 只，剩余12 只为对照组。参照文献［8-9］，AT 低、中、高剂量组腹腔注射给药5、10、20 mg/kg AT 注射液（生理盐水配制），对照组及模型组给予等量生理盐水，每组给药1 次/天，连续注射30 d。

1.3 检测指标

1.3.1 标本采集末次给药后，腹腔注射3%戊巴比妥钠麻醉，腹主动脉采血，4 ℃下3 000 r/min 离心15 min，取血清，−20 ℃保存。脊椎脱臼法处死大鼠，取膝关节，分离软骨组织，剪取部分装入无菌冻存管内，−80 ℃保存备用，其余软骨组织置入4%多聚甲醛液固定24 h备用。

1.3.2 大鼠软骨组织Mankin's 评分光学显微镜下观察软骨组织形态变化，并采用Mankin's 软骨组织学分级标准对各组大鼠软骨组织进行评分，从大鼠软骨结构、软骨细胞、潮线评定大鼠软骨组织病变程度，各部分数相加为最终得分。评分越高表明OA病变程度越严重，详细评定标准见表1。

表1 Mankin's软骨组织学评定标准

1.3.3 血清炎性因子水平检测取出ELISA试剂盒铝箔袋，置于室温1 h 平衡温度后，按照TNF-α、IL-1β、IL-6 试剂盒说明书操作，主要步骤为：取出相关板条设置板孔，分别为样品孔与标准孔，标准孔加入标准品，样品孔加入10 µL 待测样本。再添加40 µL 稀释液于样品孔，将100 µL 辣根过氧化物酶标记好的检测抗体加入各板孔中，封膜37 ℃孵育60 min，弃液并使用洗涤液清洗×5 次。将50 µL 底物A、B 液加入板孔，封膜37 ℃孵育15 min。终止反应于15 min 内在酶标仪450 nm 处检测各板孔光密度（OD）值，根据标准品梯度浓度结果建立标准曲线，计算样本浓度。

1.3.4 软骨组织HE 染色观察取出已固定好的软骨组织，置于10%EDTA 液中脱钙，梯度浓度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片机切成薄片（4µm），切片再烘干3 h至水分完全消失。将切片放入二甲苯Ⅰ10 min→二甲苯Ⅱ10 min→无水乙醇Ⅰ5 min→无水乙醇Ⅱ5 min→95%乙醇3 min→80%乙醇2 min→75%乙醇2 min 进行脱蜡复水，分别经苏木素染色10 min，盐酸分化1 s，伊红染液染色2 min，脱水透明，中性树脂封固。置于光学显微镜下观察软骨组织病理变化并拍片。

1.3.5 TUNEL 法检测软骨组织细胞凋亡取软骨组织石蜡切片，二甲苯脱蜡，乙醇脱水，浸入枸椽酸缓冲液盒60 min，PBS 冲洗×3 次，严格按照TUNEL试剂盒说明书操作，加入显色剂孵育30 min，PBS 冲洗×3 次，复染后封片，光学显微镜下移动切片观察软骨组织神经细胞凋亡情况，选择5个无重复视野，观察棕黄色的凋亡细胞数，计算凋亡率（凋亡细胞数/细胞总数×100%）。

1.3.6 RT-PCR 检测miR-98-5p、HMGA2、GSK-3β mRNA 表达取出软骨组织，预冷的PBS 清洗后迅速加入500 µL Trizol裂解液，上下吹打混匀，再加入氯仿、异丙醇，12 000 r/min 高速离心机离心15 min，离心后吸取上清，检测RNA浓度。使用TAKARA 反转录试剂盒，配制10 µL逆转录体系得到cDNA。将得到的cDNA 配制PCR 反应体系：正、反向引物各0.8 µL，ROX Refermce Dye Ⅱ 0.4 µL，SYBR Premix Ex Tap 10 µL，cDNA 2 µL，RNase free-ddH2O 6 µL。将配置好的反应体系混匀后加入PCR 板，于反应条件为95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 35 s 下进行40 个循环。取样本CT值平均数，以目的基因相对内参的表达量计算各样本之间基因表达差异，2−ΔΔCT为各样本基因的表达比较倍数。反应引物序列设计为miR-98-5p：正 向（5′-TATTGTTGTGGGGTAGGGATT-3′），反向（5′-ATAACTTCACCCCAAAAATCG-3′）；U6：正向（5′-CGTTCACGCATCTTTAAAATTGGA-3′），反向（5′-TTATGCGTGTCATCCTTGCG-3′）。HMGA2：正向（5′-CATTGGAGAAAAACGGCCAAG-3′），反向（5′-TTGCGAGGATGTCTCTTCAGT-3′）；GSK-3β：正向（5′-ATGGCAGCAAGGTAACCACAG-3′），反向（5′-TCTCGGTTCTTAAATCGCTTGTC-3′）；以β-actin 为内参，β-actin：正向（5′-GGCTG⁃TATTCCCCTCCATCG-3′），反向（5′-CCAGTTGGTA⁃ACAATGCCATGT-3′）。

1.3.7 蛋白质印迹法检测HMGA2、GSK-3β、Bax、Bcl-2 蛋白表达软骨组织裂解匀浆，4 ℃下12 000 r/min 离心15 min，吸取上清液使用BCA 蛋白浓度测定盒测定蛋白浓度，按照每组蛋白上样量20 µL，加入4 倍体积的缓冲液混匀放入恒温水浴锅中100 ℃加热10 min 进行变性，加入配制好的分离胶与浓缩胶，进行SDS-PAGE 凝胶电泳，之后将蛋白转至PD⁃VF 膜上，5%脱脂牛奶封闭2 h，加入1∶1 000 稀释的HMGA2、GSK-3β、Bax、Bcl-2 一抗，4 ℃封闭过夜，TBST 洗膜，加入二抗（1∶5 000），室温封闭60 min，TBST洗膜，滴加显影液进行显影，显影曝光，分析条带灰度值。

1.4 统计学方法运用SPSS 23.0 统计学软件分析数据，计量数据以表示，采用单因素方差分析进行多组间比较，LSD-t检验进行两组间比较。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 软骨组织学评分比较与对照组（1.71±0.12）分比较，模型组大鼠软骨组织学Mankin's 评分（8.62±0.69）分升高（P<0.05）。与模型组比较，AT 低（5.05±0.47）、中（4.68±0.36）、高剂量组（2.15±0.23）大鼠软骨组织学Mankin's评分均降低（P<0.05）。与AT 低剂量组比，AT 中、高剂量组大鼠软骨组织学Mankin's 评分降低（P<0.05）。与AT 中剂量组比，AT高剂量组Mankin's评分降低（P<0.05）。

2.2 血清炎性因子水平比较与对照组比，模型组TNF-α、IL-1β、IL-6 水平上升（P<0.05）。与模型组比，AT低、中、高剂量组TNF-α、IL-1β、IL-6水平降低（P<0.05）。与AT 低剂量组比，AT 中、高剂量组TNF-α、IL-1β、IL-6 水平降低（P<0.05）。与AT 中剂量组比，AT 高剂量组TNF-α、IL-1β、IL-6 水平降低（P<0.05）。见表2。

表2 各组大鼠血清炎性因子水平比较/（ng/L，）

表2 各组大鼠血清炎性因子水平比较/（ng/L，）

注：TNF-α 为肿瘤坏死因子-α，IL-1β 为白细胞介素-1β，IL-6 为白细胞介素-6。①与对照组比，P<0.05。②与模型组比，P<0.05。③与AT 低剂量组比，P<0.05。④与AT中剂量组比，P<0.05。

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2.3 软骨组织HE 染色比较结果显示，对照组大鼠关节软骨组织结构完整，基质均匀，表层光滑并无裂隙生成，表层细胞形态正常、排列整齐，中层细胞呈圆形或圆柱形四散分布，各层细胞均未见破坏；未见炎性细胞浸润、水肿等现象。模型组大鼠关节软骨组织结构破坏严重，表层明显变薄，形成裂隙深达钙化层，表层细胞缺失，深层细胞排列紊乱，细胞及细胞核明显受到压缩；可见大量炎性细胞浸润。AT 低、中、高剂量组大鼠关节软骨组织结构受损现象得到改善，表层逐渐平整，结构基本清晰，偶见微小裂隙，骨细胞及细胞核形态正常；炎性细胞浸润现象减少。见图1。

图1 软骨组织HE染色结果（×200）：A为对照组；B为模型组；C为AT低剂量组；D为AT中剂量组；E为AT高剂量组

2.4 软骨组织细胞凋亡率比较与对照组（8.41±1.74）%比较，模型组大鼠软骨组织细胞凋亡率（47.82±4.26）%上升（P<0.05）。与模型组比较，AT低、中、高剂量组大鼠软骨组织细胞凋亡率［（32.05±2.84）%、（23.68±2.89）%、（12.15±2.13）%］下降（P<0.05）。与AT 低剂量组比较，AT 中、高剂量组大鼠软骨组织细胞凋亡率下降（P<0.05）。与CA 中剂量组比较，AT高剂量组大鼠软骨组织细胞凋亡率下降（P<0.05）。见图2。

图2 软骨组织TUNEL染色结果（×200）：A为对照组；B为模型组；C为AT低剂量组；D为AT中剂量组；E为AT高剂量组

2.5 miR-98-5p、HMGA2、GSK-3β mRNA 水平比较与对照组比较，模型组大鼠软骨组织miR-98-5p表达水平升高，HMGA2、GSK-3β mRNA 水平降低（P<0.05）。与模型组比，AT 低、中、高剂量组大鼠软骨组织miR-98-5p 表达水平降低，HMGA2、GSK-3β mRNA 表达水平均升高（P<0.05）。与AT 低剂量组比较，AT中、高剂量组大鼠软骨组织miR-98-5p表达水平降低，HMGA2、GSK-3β mRNA 表达水平升高（P<0.05）。与AT 中剂量组比，AT 高剂量组miR-98-5p 水平降低，HMGA2、GSK-3β mRNA 水平升高（P<0.05）。见表3。

表3 大鼠miR-98-5p及HMGA2、GSK-3β mRNA水平比较/

表3 大鼠miR-98-5p及HMGA2、GSK-3β mRNA水平比较/

注：HMGA2为高迁移率族蛋白2，GSK-3β为糖原合成酶激酶-3β。①与对照组比，P<0.05。②与模型组比，P<0.05。③与AT 低剂量组比，P<0.05。④与AT中剂量组比，P<0.05。

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2.6 HMGA2、GSK-3β、Bax、Bcl-2 蛋白水平比较与对照组比，模型组HMGA2、GSK-3β、Bcl-2 蛋白水平降低，Bax 蛋白水平升高（P<0.05）。与模型组比，AT 低、中、高剂量组大鼠软骨组织HMGA2、GSK-3β、Bcl-2 蛋白表达水平升高，Bax 蛋白表达水平降低（P<0.05）。与AT 低剂量组比较，AT 中、高剂量组大鼠软骨组织HMGA2、GSK-3β、Bcl-2 蛋白表达水平升高，Bax 蛋白表达水平降低（P<0.05）。与AT 中剂量组比较，AT 高剂量组大鼠软骨组织HMGA2、GSK-3β、Bcl-2 蛋白表达水平升高，Bax 蛋白表达水平降低（P<0.05）。见表4，图3。

图3 软骨组织蛋白检测

表4 大鼠HMGA2、GSK-3β、Bax、Bcl-2 蛋白水平比较/

表4 大鼠HMGA2、GSK-3β、Bax、Bcl-2 蛋白水平比较/

注：HMGA2为高迁移率族蛋白2，GSK-3β为糖原合成酶激酶-3β，Bax为Bcl-2相关蛋白，Bcl-2为B细胞淋巴瘤因子2。①与对照组比，P<0.05。②与模型组比，P<0.05。③与AT低剂量组比，P<0.05。④与AT中剂量组比，P<0.05。

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3 讨论

关节软骨作为骨与骨之间的联合，可将外界对人体的作用力均匀分布，人的所有运动都离不开关节软骨的负荷［10］。研究表明，关节炎是在机械和生物因素共同影响下，引发软骨基质降解、软骨细胞自身代谢紊乱的退行性疾病［11］。关节软骨由基质与软骨细胞组成，软骨组织需靠仅占组织1/10 的软骨细胞进行正常代谢，所以代谢缓慢和修复能力低都使OA 难以完全治愈，一旦发病会将不断反复发作，疼痛难忍［12］。目前现代医学的医治方法主要以非甾性抗炎药为主，但非甾性抗炎药对肠胃的毒副作用明显，因此，寻找更加安全、毒副作用低的药物对OA临床治疗有着重大意义［13］。

AT 是提取自菊科植物白术根茎的生物活性成分，是一种倍半萜烯类化合物。现代药理学研究证实了AT 具有多种药理活性，包括抗炎、抗病毒、抗溃疡、保肝及抗肿瘤等［14］。中医学对OA 的研究极为久远，已有研究发现，AT 可代替非甾性药物对软骨损伤修复有着良好效用［15］。横断前后交叉韧带和切除半月板造模方法可引起软骨表面缺失、表层基质缺陷、软骨细胞代谢紊乱等改变，与OA 病人临床表现十分贴近，是公认的OA 造模方法［16］。故本研究建立OA 大鼠模型，结果显示，模型组大鼠软骨组织学Mankin's评分降低，血清TNF-α、IL-1β、IL-6、细胞凋亡率水平上升，表明模型组大鼠软骨组织受到损伤且伴有炎症反应，在给予不同剂量AT 治疗后上述指标水平降低，提示AT 可缓解大鼠体内炎症反应，修复软骨损伤。此外，软骨组织HE 染色和TUNEL 染色结果也表明软骨各基层结构受损现象得到改善，细胞肿胀、炎性细胞浸润现象和软骨细胞凋亡现象明显减少，进一步证实AT 可以抑制软骨细胞的凋亡，对软骨组织损伤具有修复作用。

在本研究中，模型组大鼠软骨组织miR-98-5p表达水平升高，HMGA2 和GSK-3β 基因表达和蛋白表达水平明显降低，同时研究发现，模型组大鼠促凋亡蛋白Bax 蛋白表达水平升高，且抑凋亡蛋白Bcl-2 表达降低。结合模型组大鼠软骨细胞凋亡率升高，表明模型组大鼠软骨组织受到损伤后，体内miR-98-5p 水平骤然升高，HMGA2/GSK-3β 信号通路被激活，细胞凋亡与抑凋亡平衡被打破，导致大量骨细胞凋亡流失。微小RNA（microRNA， miR⁃NA）是一种由19~25 个核苷酸组成的非编码小RNA，参与机体内细胞增殖、分化、迁移、凋亡等生理过程。miR-98-5p 是miRNAs 家族在肿瘤和骨骼方向倍受关注的成员之一，其可以通过抑制HM⁃GA2表达抑制细胞凋亡，GSK-3β是一种多功能丝氨酸/苏氨酸激酶，可调节能量代谢、细胞生长和凋亡，是HMGA2 反向底物和效应器［17］。miR-98-5p/HM⁃GA2/GSK-3β 轴是调控骨细胞生长的重要通路，在正常的生理状态下维持着骨组织的动态平衡［18］。与模型组比较，AT 各剂量组大鼠软骨组织miR-98-5p 表达、Bax 蛋白表达水平降低，HMGA2、GSK-3β mRNA 和Bcl-2 蛋白表达水平均升高。结合大鼠软骨组织细胞凋亡率变化，可见AT 能够干扰miR-98-5p 促进HMGA2、GSK-3β 蛋白表达抑制软骨细胞凋亡，对大鼠软骨损伤有积极影响。

综上所述，AT 能够调整OA 大鼠血清炎性因子水平，抑制软骨细胞凋亡，可能是通过干扰miR-98-5p，促进HMGA2、GSK-3β 蛋白表达发挥作用，为临床治疗OA提供实验依据。

（本文图1，2见插图8-1）