阿托伐他汀钙对脂多糖诱导急性肺损伤小鼠核因子E2相关因子2/血红素加氧酶-1通路的影响

李姗，王荣丽

作者单位：西南医科大学附属医院呼吸与危重症医学科，四川 泸州 646000

急性肺损伤（ALI）是一种由机体创伤、烧伤、重症感染、休克、弥散性血管内凝血等因素触发并以逐渐进展的呼吸困难、难以逆转的氧合障碍、非心源性肺水肿为临床特征［1］的危急重症。急性呼吸窘迫综合征是ALI 进展的严重阶段，发病率及死亡率高［2］，至今仍然缺乏特效治疗药物。阿托伐他汀钙（AVT）属于3 羟基-3 甲基戊二酰辅酶A（HMG-CoA）还原酶选择性、竞争性抑制剂，除针对心血管系统调节血脂、抗动脉粥样硬化外，还可抑制炎症、调节氧化应激、调节免疫、改善内皮功能等［3-6］。已有文献［7-8］报道，受核因子E2 相关因子2（Nrf2）调控的下游因子血红素加氧酶1（HO-1）表达增强能抑制炎症细胞如中性粒细胞、巨噬细胞等介导的炎症反应，但AVT 是否也能通过该通路减轻脂多糖（LPS）诱导的ALI 小鼠炎症反应仍需进一步验证。研究时间2021年9―12月。

1 材料与方法

1.1 动物15 只4～6 周龄健康雌性BALB/c 小鼠，购自湖北省实验动物研究中心，合格证号［SCXK（鄂）2020-0018］，体质量范围为19～22 g。

1.2 药品与试剂AVT（货号A121956，规格250 mg，纯度98%）；LPS（货号L118716，规格10 mg，纯度99%），均购自上海阿拉丁有限公司。小鼠肿瘤坏死因子-α（TNF-α）酶联免疫吸附（ELISA）试剂盒（货号ELK1395，规格96T）、白细胞介素-1β（IL-1β）ELISA试剂盒（货号ELK1271，规格96T）均购自武汉科鹿生物科技有限公司；山羊抗兔二抗（货号AS1107，规格100 µL）购自武汉阿斯本生物技术有限公司；Nrf2兔抗鼠抗体（货号16396-1-AP，规格150 µL）购自武汉三鹰生物技术有限公司；HO-1 兔抗鼠抗体（货号#43966，规格100 µL）购自美国CST公司。

1.3 仪器ABL700 全自动血气分析仪，购自瑞士罗氏公司；RM2016 病理切片机，购自上海徕卡公司； DR-200Bs酶标仪，购自Diatek公司。

1.4 小鼠分组及建立ALI模型15只BALB/c 雌性小鼠采用随机数字表法分为NS 组、LPS 组、LPS+AVT 组，每组5 只。LPS 组、LPS+AVT 组以尾静脉注射 LPS 4 mg/kg构建ALI动物模型，NS组则以相同方式注射等量生理盐水。小鼠出现精神萎靡、活动减少、呼吸急促、四肢及口唇发绀为模型建立成功。建模1 h 后，LPS+AVT 组予以 AVT 10 mg/kg灌胃，其余组分别以等量生理盐水灌胃。建模后6 h 以水合氯醛腹腔麻醉小鼠，采集腹主动脉血1 mL，并用颈椎脱臼法处死。

1.5 测定动脉氧分压（PaO2），计算氧合指数（PaO2/FiO2）比值取腹主动脉血1 mL，使用全自动血气分析仪，检测PaO2并计算PaO2/FiO2比值（呼吸空气情况下吸入氧浓度FiO2为21%）。

1.6 肺组织HE 染色取出小鼠左肺组织，分别进行固定、脱水、包埋、切片、HE 染色，光镜下观察小鼠肺组织病理形态学改变。

1.7 肺组织湿干重（W/D）比值取出右肺中叶，称重，测定湿质量（W）后置于85 ℃恒温烘干箱中36 h，再称重测出干质量（D），计算W/D比值。

1.8 肺泡灌洗液TNF-α、IL-1β 检测处死小鼠后钝性分离出气管，进行气管插管，以1 mL 预冷生理盐水灌洗、回抽，重复3 次。将回收后的灌洗液混匀，在冰冻离心机4 ℃下，以3 000 r/min 离心10 min，取出上清液，据TNF-α、IL-1β ELISA 试剂盒说明书检测TNF-α、IL-1β含量。

1.9 小鼠肺组织Nrf2、HO-1 蛋白检测取各组小鼠右肺下叶组织，用BAC 法测定肺组织总蛋白浓度后，取40 µg蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，PVDF膜恒流转膜后室温封闭，加入一抗Nrf2 抗体（稀释比1∶500）、HO-1 抗体（稀释比1∶2 000）、GAPDH 单克隆抗体（稀释比1∶10 000）过夜。回收一抗，TBST 洗涤3次，然后室温下孵育二抗（稀释比1∶10 000），TBST洗涤4次。均匀滴加现配的ECL混合溶液（显影液∶定影液=1∶1）到膜蛋白面侧，据光强度不同调整曝光条件。用AlphaEaseFC 软件扫描胶片，以目标带与GAPDH 带的光密度比值作为结果进行统计学分析。

1.10 统计学方法应用统计软件SPSS 17.0，计量资料以表示，多组间比较用单因素方差分析，其中两两比较行LSD-t检验。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠肺组织病理改变HE 染色可呈现小鼠因肺组织损伤而形成的病理学改变。如图1，NS 组小鼠肺泡结构清晰度、完整度高，肺泡壁均一，肺间隔薄，肺泡腔干净。LPS组小鼠肺泡结构混乱不清，肺泡壁不均匀，肺间隔变厚，肺泡腔及间隔里大量炎性细胞渗出堆积；LPS+ AVT组小鼠肺泡结构较清晰完整，肺泡壁也较均一，肺间隔轻度增厚，炎性渗出浸润减少。

图1 各组小鼠肺组织结构（HE×100和HE×400）

2.2 小鼠动脉血气分析由检测的小鼠PaO2水平了解肺部缺氧程度，并根据其数值计算PaO2/FiO2以评估其肺部呼吸功能急性损伤情况。如表1 显示，LPS 组小鼠的PaO2、PaO2/FiO2均显著低于NS 组（P<0.05），而LPS+AVT 组小鼠PaO2及PaO2/FiO2均高于LPS组（P<0.05）。

表1 小鼠动脉血PaO2、PaO2/FiO2和肺组织W/D比值/

表1 小鼠动脉血PaO2、PaO2/FiO2和肺组织W/D比值/

注：PaO2为动脉氧分压，PaO2/FiO2为氧合指数，W/D为湿/干比值。①与NS组比较，P<0.05。②与LPS组比较，P<0.05。

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2.3 小鼠肺组织W/D 比值检测小鼠肺组织W/D比值以评估肺部血管渗漏和肺组织水肿程度。如表1显示，LPS组小鼠W/D比值高于NS组（P<0.05），而LPS+ AVT组小鼠W/D比值低于LPS组（P<0.05）。

2.4 小鼠BALF 中TNF-α 、IL-1β 水平采用ELI⁃SA 法检测小鼠BAF IL-1β、TNF-α 的含量，以反映小鼠肺部炎症水平。根据结果分析，LPS 组小鼠的TNF-α、IL-1β 水平均显著高于NS 组（P<0.05），而LPS+AVT组小鼠上述炎性因子水平均明显低于LPS组（P<0.05）。见表2。

表2 小鼠BALF IL-1β、TNF-α 水平及肺组织Nrf2、HO-1蛋白表达比较/

表2 小鼠BALF IL-1β、TNF-α 水平及肺组织Nrf2、HO-1蛋白表达比较/

注：BALF为肺泡灌洗液，TNF-α为肿瘤坏死因子-α，IL-1β为白介素-1β，Nrf2为核因子E2相关因子2，HO-1为血红素加氧酶1。①与NS组比较，P<0.05。②与 LPS组比较，P<0.05。

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2.5 小鼠肺组织Nrf2、HO-1 蛋白表达比较通过蛋白质印迹法测定小鼠肺组织Nrf2、HO-1蛋白的表达水平，以评估Nrf2/HO-1 通路的激活或抑制状态。经结果分析，LPS 组小鼠Nrf2、HO-1 表达水平均显著低于NS 组（P<0.05），而LPS+AVT 组小鼠Nrf2、HO-1表达水平高于LPS组（P<0.05）。见表2，图2。

图2 各组小鼠肺组织中Nrf2、HO-1蛋白水平

3 讨论

AVT 对HMG-CoA 还原酶起特异性抑制效应，通过阻碍HMG-CoA 向甲羟戊酸转化实现调脂、抗动脉粥样硬化作用。研究［9］发现AVT能下调黏附分子表达，降低促炎细胞因子及补体末端产物水平，减少核转录因子-κB p65磷酸化，抑制炎症细胞浸润和组织损伤。据黄兴汉［10］研究，脑缺血再灌注后的大鼠经AVT 处理，其梗死灶周围中性粒细胞较对照组明显减少，表明AVT 可抑制脏器炎症损伤中炎症细胞的浸润。为了验证AVT对ALI小鼠发挥积极的炎症保护作用并探索可能存在的新机制，我们开展了这个实验，以期为AVT 在ALI 的应用提供更多的理论依据。

ALI 早期肺泡基底膜受损，肺微血管通透性增加，蛋白质、液体在肺间质聚集引起水肿，并向肺泡内渗漏［11］，随后出现肺容积减少、顺应性下降、通气血流比例失调等众多病理生理改变，进而导致以PaO2下降为主的急性呼吸功能衰竭。本研究采用LPS呈现ALI模型，可见ALI小鼠因肺间隔和肺泡腔内大量炎性细胞渗出堆积导致肺泡结构混乱不清，肺组织含量水高。并且，ALI 小鼠出现低氧血症的同时，其动脉血气分析的结果也符合ALI 的诊断标准，即PaO2/ FiO2≤300 mmHg［12］。上述结果均能说明此次LPS 诱导的小鼠ALI 模型是成功的。此外，研究结果还可见AVT的治疗可以减轻ALI小鼠肺泡结构破坏程度，减少炎性细胞渗出堆积，降低肺组织含水量，改善肺部呼吸功能受损。

LPS 诱导的ALI 病情进展迅速，涉及炎症、氧化应激、离子通道改变、细胞凋亡等多个环节［13-14］。IL-1β、TNF-α 均参与炎症的级联放大效应［15］。多形核白细胞作为主要的炎症细胞，通过上调其表面的细胞黏附分子CD11/CD18、P-选择素等，在肺内过度聚集、浸润、活化，释放许多具有生物损害作用的组织蛋白酶、TNF-α 等炎性物质。IL-1β、TNF-α 同时也具备促炎能力，当肺内巨噬细胞受到炎性或损伤刺激时也可分泌这两种物质，以作用于多形核白细胞和其他炎症细胞，促使更多的炎性介质和细胞因子产生、扩散，正反馈循环得到启动，加重肺损伤［16］。我们的研究可见，LPS 诱导后的两组小鼠肺泡灌洗液IL -1β、TNF-α 含量均高，提示炎症反应得到启动；而LPS+AVT组的小鼠IL -1β、TNF-α水平降低，提示炎症反应有所抑制。因此，若能阻断炎症放大反应，也许能够延缓ALI病情进展。

研究表明激活Nrf2/HO-1 通路在氧化应激、炎症反应、组织损伤中具有积极作用［17-19］。Nrf2 为帽领碱性亮氨酸拉链转录激活因子家族成员，由高度保守的结构域Neh1~7 组成，受Kelch 样环氧氯丙烷相关蛋白-1（Keap1）负向调控，是调节细胞氧化应激反应的重要因子，参与抗炎、抗氧化、凋亡等过程。机体处于生理状态时，Nrf2 经Neh2 与Keap1 结合在胞质中。在各种应激情况下，Keap1 末端的半胱氨酸残基发生氧化还原反应被修饰，因此构象改变。从胞质中Keap1 上脱离的Nrf2，经磷酸化和易位入核，在核内同Maf 蛋白和Jun bZip 转录因子形成异源二聚体，再以Neh4、Neh5 与抗氧化反应元件精准结合。随后在环腺苷酸效应元件结合蛋白、转录激活因子等作用下，Nrf2介导的转录过程得以启动，正向调控下游靶基因，启动抗氧化酶、Ⅱ相解毒酶等活性调节［7，17，20］。HO-1，又称热休克蛋白32，是Nrf2调控的下游酶物质，普遍存在于哺乳动物体内血细胞代谢旺盛的骨髓、肝、脾等脏器中。在烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、细胞色素P450 的参与下［7］，HO-1 将血红素降解为胆绿素、一氧化碳和亚铁离子，进而产生抗氧化、抗炎、抗凋亡等积极作用［17，21］。于是，我们作出假设，AVT 对ALI 小鼠的保护效应也可能与此条信号通路有关。为了验证这种假设，本研究以AVT 作为干预药物，发现给予了AVT 灌胃的ALI小鼠Nrf2 和HO-1 蛋白表达均上调，肺组织损伤和呼吸功能也有所改善，表明AVT 可通过激活Nrf2/HO-1通路发挥抗炎效应。文献［18］报道，从珍贵的传统中草药冬虫夏草中提取的嘌呤类生物碱冬虫夏草素能够诱导Nrf2 从细胞质转位到细胞核并激活，以此上调ALI大鼠肺组织中HO-1的表达和酶活性，从而缓解肺组织损伤。据此，我们推测，本研究中AVT 对Nrf2/HO-1 通路的激活作用也可能与促进Nrf2 转位入核致Nrf2 转录增加有关，但仍需进一步的实验研究证明。

综上所述，AVT 可减轻LPS 诱导ALI 小鼠的炎症反应，这可能与激活Nrf2/HO-1通路有关。