不同镉耐受性香菇子实体对镉胁迫的生理响应

2023-07-13翟丹丹闫苗苗姜宁李巧珍尚晓冬谭琦李玉于海龙

农业环境科学学报 2023年6期

翟丹丹，闫苗苗，姜宁，李巧珍，尚晓冬，谭琦，李玉，于海龙*

（1.吉林农业大学食药用菌教育部工程研究中心，长春 130118；2.上海市农业科学院食用菌研究所，农业农村部南方食用菌资源利用重点实验室，国家食用菌工程技术研究中心，国家食用菌加工技术研发中心，上海市农业遗传育种重点开放实验室，上海 201403）

香菇（Lentinula edodes）是我国第一大食用菌品种，其产量占我国食用菌总产量的31%以上，其味道鲜美、营养丰富，深受消费者喜爱[1]。重金属可以通过生物富集进入人体[2]，对人体造成一定的毒性损伤[3]。食用菌具有重金属富集特性最早是由Stijve等[4]报道，后续又有大量的研究报道证实很多大型真菌都具有重金属富集特性[5-6]，且其富集程度大于植物[7]。研究发现，不同种类间、同一种类不同品种间、同种内不同菌株间、同一个体不同部位间的重金属富集程度和含量都有差异[8-9]。前期研究表明，香菇子实体中镉含量存在超标现象，栽培区域、基质、品种、栽培方式等生产因素都会对香菇中镉含量产生影响[10]，不同潮次、不同部位、不同生长发育阶段的香菇子实体中的镉含量也会有显著差异[11-12]。在对灵芝[13]、猴头菇[14-15]、香菇[16-17]的研究中证实，食用菌生长发育过程中的活性物质累积是一个动态过程，当生物体受到胁迫时，其渗透调节物质如可溶性蛋白等的含量会发生显著变化，以维持细胞正常代谢[18]，而丙二醛（MDA）是衡量非生物胁迫后细胞氧化损伤程度的重要指标[19]，探究镉胁迫对香菇菌株不同生长发育阶段镉含量及活性物质积累的影响，可以进一步了解香菇子实体内镉积累的生理机制。前期本课题组以菌丝生长速率和镉含量为指标对99份香菇种质资源进行镉耐受性评价，获得了不同镉耐受性的香菇菌株和外源镉胁迫下的表型差异[20]。本研究以4606（镉积累较低）和4625（镉积累较高）两个不同镉耐受性香菇菌株为供试菌株[21]，通过外源添加镉胁迫，探究两个菌株不同发育阶段子实体中镉含量、MDA含量、可溶性蛋白含量的变化规律，明确不同镉耐受性香菇菌株在不同发育阶段对镉胁迫的生理响应差异，以期为阐明不同镉耐受性香菇菌株镉胁迫应答提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试菌株及培养基

香菇菌株4606（国品认菌2007004）和4625（国品认菌2008007），由国家食用菌工程技术研究中心提供。

PDA 培养基（购自美国BD 公司）：将PDA 培养基按照说明书中的方法进行配制，将配制好的培养基于121 ℃高压灭菌30 min。

原种及栽培种培养料配方：栎木屑79%、麦麸20%、石膏1%，含水量57%~58%，pH自然。

1.2 试验方法

1.2.1 菌袋制作及培养

无镉添加的对照组栽培种培养料按照1.1中的配方配制。镉添加的培养料按照每千克培养料添加500µL氯化镉母液（10 g·L-1）的比例配制。培养料混匀后测定接种前单位干质量培养料中的实际镉含量，其中对照组为（0.386±0.059）mg·kg-1、处理组为（6.918±0.484）mg·kg-1。称取1 kg培养料装入聚丙烯袋，并保持装料高度一致，封口后121 ℃高压灭菌4 h，料温降到28 ℃以下接种，接种量为3%（体积比），接种后将菌棒放入培养室（23±1）℃避光培养，菌棒中心温度不超过26 ℃，空气相对湿度60%~80%；待菌棒发满菌后，调控温度、湿度、光照及通气等条件促进转色：温度（23±1）℃，空气相对湿度60%~80%，光照强度50~200 lx，每天光照时长不少于12 h。

1.2.2 出菇管理

接种后150 d 进行出菇处理，将菌棒置于环境参数可控的出菇房，设置（12±1）℃进行催蕾，48 h 后菇房温度设置为（17±1）℃进行出菇，空气相对湿度85%~95%，光照强度100~200 lx，出菇管理过程中不疏蕾。

1.2.3 子实体农艺性状测定

每个处理取12个菌棒，每3个菌棒为一次生物重复，测定香菇子实体农艺性状。

1.2.4 MDA含量及可溶性蛋白含量测定

将香菇子实体发育分为原基期、生长期、成熟期、开伞期4 个阶段，每个时期3 个重复菌棒，按照图1 所示收集4 个时期子实体样品，样品经液氮速冻并研磨后，称取0.1 g 于2 mL 离心管，并于-80 ℃超低温冰箱保存。使用MDA 试剂盒测定MDA 含量，使用考马斯亮蓝法测蛋白含量试剂盒测定可溶性蛋白含量，两种试剂盒均购自苏州科铭生物有限公司。

图1 香菇子实体不同生长发育阶段示意图Figure 1 Schematic diagram of different growth and development stages of Lentinula edodes fruiting bodies

1.2.5 镉含量测定

随机选取对照及镉添加的未接种培养料各5 棒，以及出菇后不同发育阶段子实体样品，置于50 ℃烘箱中烘干至恒质量，粉碎研磨，过80 目筛，于干燥处保存备用。参照GB 5009.15—2014[22]的方法测定培养料与香菇子实体中单位干质量的镉含量。

1.2.6 数据处理

采用Excel 对获得的数据进行分析，使用SPSS 23.0[23]进行单因素方差分析并进行差异显著性检验（Duncan，P<0.05）及相关性分析（Pearson）。

2 结果与分析

2.1 对子实体农艺性状及产量的影响

镉胁迫对不同镉耐受性菌株的主要农艺性状和产量变化有不同影响（表1）：菌株4606受到镉胁迫后菌盖直径和菌盖厚度显著降低，其余农艺性状未受到显著影响；菌株4625 受到镉胁迫后单棒子实体个数、单棒产量显著降低，单菇质量、菌盖质量显著升高，其余农艺性状未受到显著影响。镉胁迫对菌株4625 的主要农艺性状和产量的影响更大。

表1 镉胁迫对香菇子实体农艺性状的影响Table 1 Effects of Cd stress on agronomic characters of Lentinula edodes fruiting bodies

2.2 对子实体不同发育阶段镉含量的影响

对镉胁迫后不同镉耐受性香菇子实体不同发育阶段中镉含量进行方差分析，结果如图2。外源添加镉胁迫后菌株4606 各生长阶段的镉含量分别为原基期（68.817±4.479）mg·kg-1、生长期（69.760±6.114）mg·kg-1、成熟期（53.667±8.791）mg·kg-1、开伞期（45.170±8.205）mg·kg-1，菌株4625 分别为原基期（128.900±14.465）mg·kg-1、生长期（95.573±1.406）mg·kg-1、成熟期（79.580±1.456）mg·kg-1、开伞期（60.950±1.291）mg·kg-1。菌株4625 的4 个生长发育阶段子实体中镉含量均表现为：原基期>生长期>成熟期>开伞期；菌株4606的原基期与生长期无显著差异，成熟期与开伞期的镉含量显著低于原基期与生长期。结果说明子实体中镉含量随着子实体生长发育时间的延长，有逐步降低的趋势。对镉胁迫后两个菌株不同生长发育阶段中的镉含量进行分析发现，受到镉胁迫后，菌株4625在不同生长发育阶段的镉含量均远高于菌株4606，其中原基期的差异倍数最大，为菌株4606原基期的1.873倍，说明菌株4625更容易吸收培养料中的镉。

图2 镉胁迫对香菇不同发育阶段子实体镉含量的影响Figure 2 Effects of Cd stress on Cd content in fruiting bodies of Lentinula edodes at different developmental stages

2.3 对子实体MDA含量的影响

镉胁迫对子实体MDA 含量的影响见图3。菌株4606对照组MDA含量随生长时间的延长先显著降低后显著升高，生长期MDA 含量显著低于其他发育阶段，镉胁迫处理后菌株4606 的MDA 含量先上升后显著降低，生长期MDA 含量最高，为（8.967±1.149）nmol·g-1；将相同生长发育阶段镉胁迫前后子实体MDA 含量进行对比，发现镉胁迫前后原基期MDA 含量无显著差异，生长期MDA 含量在镉胁迫后显著升高，且高于对照组1.249 nmol·g-1，成熟期MDA 含量在镉胁迫后显著下降，且低于对照组0.629 nmol·g-1，开伞期MDA含量在镉胁迫后极显著降低，且低于对照组1.066 nmol·g-1。菌株4625对照组MDA含量随生长时间的延长先显著降低后显著升高，成熟期MDA含量最低，镉胁迫处理后菌株4625 的MDA 含量随生长时间的延长显著降低，成熟期MDA 含量最低；将相同生长发育阶段镉胁迫前后子实体MDA含量进行对比，发现镉胁迫前后原基期、生长期、成熟期MDA 含量无显著差异，开伞期MDA 含量在镉胁迫后显著降低，且低于对照组1.720 nmol·g-1。

图3 镉胁迫对不同阶段香菇子实体MDA含量的影响Figure 3 Effects of MDA content in the fruiting bodies of Lentinula edodes at different stages under Cd stress

2.4 对子实体中可溶性蛋白含量的影响

测定不同阶段香菇子实体中可溶性蛋白含量发现（图4），菌株4606对照组与镉胁迫组的可溶性蛋白含量均随生长时间延长显著下降，而菌株4625 对照组与镉胁迫组不同发育阶段可溶性蛋白含量均随生长时间延长先显著升高后显著降低，生长期可溶性蛋白含量最高，开伞期可溶性蛋白含量最低。将相同生长发育阶段镉胁迫前后子实体中可溶性蛋白含量进行比较，发现镉胁迫导致菌株4606 子实体开伞期可溶性蛋白含量显著降低，而菌株4625 原基期、生长期、开伞期子实体可溶性蛋白含量极显著升高。

图4 镉胁迫对不同阶段香菇子实体可溶性蛋白含量的影响Figure 4 Effects of soluble protein content of Lentinula edodes fruiting bodies under Cd stress at different stages

3 讨论

重金属污染是被广泛关注的世界性问题，且重金属属于非氧化还原金属，其不仅会对环境造成污染，还可能通过食物链进入人体而威胁人体健康，严重时可能会造成重金属中毒。有研究发现，镉胁迫下姬松茸子实体数量显著减少[24]，平菇子实体的产量降低[25]，杏鲍菇子实体产量及生物学效率降低[26]。本试验发现镉胁迫造成菌株4625 单棒子实体个数、单棒产量显著低于对照，但菌株4606 受到镉胁迫后的菌盖直径、菌盖厚度显著降低，其余农艺性状未受到显著影响。刘朋虎等[27-28]以两个不同镉耐受性姬松茸菌株为材料进行研究，发现外源镉添加对两菌株子实体农艺性状产生的影响各异，且该影响与外源添加的镉浓度相关。本试验发现镉胁迫对两个不同镉耐受性香菇菌株的农艺性状也产生不同影响，这可能与前期课题研究证实的菌株4625和菌株4606对镉胁迫表现出不同的应答模式有关[21]。生物体在不同生长发育阶段对环境胁迫的适应能力不同[29]。本试验发现两个不同镉耐受性香菇菌株子实体中镉含量均有随着子实体生长发育时间的延长而显著降低的趋势，这与吴阳[30]的研究结果一致。受到镉胁迫后，菌株4625在不同生长发育阶段的镉含量均远高于菌株4606，说明相比于菌株4606，菌株4625 更容易吸收培养料中的镉。

MDA 含量是细胞膜脂过氧化的检验指标，间接表示细胞膜系统的受损害程度，其含量越高说明受到的伤害越重。正常情况下，生物体的MDA 含量很低，但受到胁迫后，MDA 的变化可以反映菌株的脂质过氧化程度，间接反映菌株的抗胁迫能力。董洪新等[31]发现猪肚菇子实体未生长成熟前其子实体内SOD 和CAT 具有较高的活性氧清除能力，MDA 含量水平较低。镉胁迫菌株4606 幼菇期的MDA 含量显著高于对照组幼菇期，这可能是因为菌株4606 子实体生长发育前期还未形成完备的抗性系统，镉胁迫导致菌株4606胞内脂质过氧化损伤；镉胁迫下，菌株4606成熟期、开伞期的MDA 含量以及菌株4625开伞期的MDA含量显著低于对照组相应生长发育阶段，这可能是后期胞内抗氧化系统被诱导，在一定程度上削弱了镉胁迫造成的细胞脂质过氧化[32]。魏杰等[33]在研究盐胁迫对西藏拟溞MDA 影响的过程中也发现高盐胁迫下的MDA 含量均低于对照组，且随着盐胁迫浓度的升高，部分抗氧化酶活性增强，机体的渗透调节功能加强，从而可清除代谢过程中产生的自由基，进而减少机体氧化损伤。因此，我们推测本试验部分发育阶段MDA 含量显著低于对照可能也是受到菌株内抗氧化酶系及渗透调节物质的影响。本试验发现镉胁迫处理后菌株4606 不同发育阶段的MDA 含量相比于对照组先上升后显著降低，而镉胁迫处理后菌株4625原基期、生长期、成熟期的MDA 含量未受到显著影响，但镉胁迫后开伞期MDA 含量相比于对照组显著降低，且镉胁迫处理后菌株4625 开伞期MDA 含量（1.720 nmol·g-1）的下降程度高于菌株4606（1.066 nmol·g-1），整体上，相比于菌株4606，镉胁迫处理对菌株4625氧化损伤的程度更低。结合菌株4625受到镉胁迫的产量性状来看，虽然镉胁迫下菌株4625 开伞期MDA 含量显著低于对照组，但菌株4625 的农艺性状和产量受镉胁迫影响较大，这可能是由于生物体受到胁迫时会主动调整生长发育与胁迫适应之间的关系来应对胁迫[34]。Carpenter 等[35]的研究发现部分生物在遇到某些逆境时会选择延迟或减少生殖生长，推测这可能是生物体内泛素化蛋白酶体失活，无法清除体内的错误折叠或变性蛋白而导致生育受阻造成的[36]。

可溶性蛋白是重要的营养物质和渗透调节性物质，可对外界刺激迅速反应，是有机体合成代谢及分解的指示剂[37]。本试验发现菌株4606 的可溶性蛋白含量均随生长时间延长显著下降，这与王东明等[38]的研究结果一致。宋鹏等[39]发现镉胁迫条件下双孢蘑菇抗氧化酶和可溶性蛋白含量受镉胁迫时间的影响，菌株4606 的代谢水平随生长发育时间的延长逐渐降低，菌株4625 的可溶性蛋白含量随生长时间延长先显著升高后显著降低，可溶性蛋白作为研究酶活的重要指标，间接反映出菌株4625 的总体代谢水平随生长时间延长先显著升高后显著降低，这也与MDA 含量变化趋势相互印证。菌株4625 在不同生长发育阶段的镉含量均远高于菌株4606，这可能是菌体中特定成分可溶性蛋白和协同抗氧化酶系的共同作用，增强了菌株对外源镉的耐受性[40]。