膨润土中硫酸盐还原菌对As和N的还原作用

蒙薪赟，赵嘉，刘璟

（西南大学资源环境学院，重庆 400715）

砷（As）是一种有毒、致癌的类金属元素，通常存在于矿物中，并通过采矿、冶炼、矿物风化和大气降水等途径广泛分布于自然界中，进而对人类健康和生态环境构成潜在威胁[1-3]。一般来说，黏土对As 具有较好的吸附和固定效果。Yamazaki 等[4]调查了孟加拉国一村庄土壤中的As 含量，发现黏土中的As 含量为20~111 mg·kg-1，而沙土中的As 含量则为3~7 mg·kg-1。在厌氧条件下，As 通常为毒性和流动性更强的三价态[As（Ⅲ）]，因此富含黏土矿物且长期处于淹水缺氧环境的土壤受到的As 污染较为严重[5-8]。土壤As污染问题已越来越引起人们的关注。

氮（N）是农业土壤中的主要养分之一，土壤中N素的转化及其含量的高低，对作物产量和生态平衡影响重大[9-10]。N 在固-液体系中以铵盐、亚硝酸盐和硝酸盐等形态存在并进行转换，在水体中具有很高的溶解度，会通过硝化作用氧化成，再通过反硝化作用转化为N2O和N2，会异化还原为。N和As同处于农田土壤环境中，如果能通过研究发现两者间的联系和其形态变换规律，将为土壤As 污染治理和修复提供新思路。

土壤中黏土矿物的含量对As 的吸附和N 含量的变化均有影响[13-14]。膨润土[Al2O3·4（SiO2）·H2O]主要由蒙脱石组成，是一种2∶1 类型的黏土矿物，是国内外开发最早、应用最广泛的非金属矿产之一，具有良好的缓冲和吸附效果，在环境污染治理方面发挥着重要作用[15-17]。由于膨润土具有较大的比表面积和较强的阳离子交换能力及吸附能力，可通过络合作用吸附金属离子，所以膨润土及其改性产品常作为吸附剂吸附As 等重金属[18]。Mar 等[19]通过等温吸附实验得出膨润土的As（Ⅴ）吸附量最高可达0.33 mg·g-1。程冰冰等[20]通过干法提纯得到的膨润土对As（Ⅴ）的最大吸附量达0.186 mg·g-1。Su 等[21]用阳离子表面活性剂改性制备的有机膨润土，可去除水溶液中As（Ⅴ）和As（Ⅲ）。除此之外，膨润土也可作为微生物的天然养分载体，提高土壤中微生物的存活率[22]。因此，膨润土可作为吸附剂和微生物载体用于本研究。在土壤环境中，硫（S）的氧化还原也会影响到As，厌氧环境下硫酸盐还原菌（Sulfate-reducing bacteria SRB）等厌氧微生物会影响土壤中As 和N 的流动及变化[23-24]。目前，关于As 污染和N 素转化的研究较多，但将两者联系起来的研究相对较少。因此，本研究以膨润土为载体，SRB 为优势菌种，探究厌氧环境下不同因素对膨润土固液体系中As 和N 的影响以及两者间的联系，以丰富对矿区土壤As污染的防控认识。

1 材料与方法

1.1 硫酸盐还原菌的培养

本实验所用的硫酸盐还原菌来自四川西南某铜矿区，用固体培养基进行培养，平板划线后分离纯化，经鉴定为Desulfovibrio vlugarisMiyazaki，以下简称SRB。本研究所用培养基为德国微生物和细胞培养物保藏库（DSMZ）所记录的DSMZ 63 标准培养基（http：//www.dsmz.de/microorganisms）[25]。该培养基含有K2HPO4（0.5 g·L-1），MgSO4·7H2O（2 g·L-1），Na2SO4（1 g·L-1），CaCl2·2H2O（2 g·L-1），Yeast extract（1 g·L-1）和DL-Na-lactate（2 g·L-1）。将硫酸盐还原菌接种至上述培养基7 d 后取48 mL 以10 000 r·min-1（5810，艾本德，中国）离心20 min，倒掉上清液后用超纯水定容至50 mL，摇匀备用。

1.2 实验设计

1.2.1 SRB厌氧微宇宙实验

开展微宇宙实验以研究不同SRB 活性对膨润土中N 和As 形态以及浓度的影响，通过设置不同的SRB 生长环境：超纯水、标准DSMZ 63 培养液和寡营养培养液（1%的DSMZ 63 培养液），分别建立有差异的SRB生长活性环境。以超纯水为控制对照组，另外两种营养条件作为实验组。在250 mL 的三孔蓝盖瓶中分别加入上述溶液196.76 mL，然后加入1 g 膨润土，用移液枪吸取对数期生长良好的SRB 菌液2 mL注入上述瓶中，加入1.2 g 硝酸钠作为N 源，1.24 mL As（Ⅴ）储备液（1 g·L-1）作为As 源，最终使得瓶中溶液体积达到200 mL，初始As 浓度和N 浓度分别为6 200 μg·L-1和4 200 mg·L-1。连续通入10 min 氩气以创造厌氧环境，然后将三孔蓝盖瓶置于35 ℃，150 r·min-1下振荡（IS-RDD3）。试验周期为7 d，每天定时用10 mL 针管抽取样品溶液，样液过0.45µm 滤膜后，测定As 形态[As（Ⅲ）、As（Ⅴ）]和N 形态和。

1.2.2 共存N和有机酸影响实验

对于N 浓度添加影响，参考1.2.1 部分，在其他实验条件不变的前提下，改变硝酸钠的添加量（0、0.3、1.2 g）开展相应微宇宙实验。对于共存有机物的影响，分别选用乙酸钠和腐植酸作为代表性小分子和大分子酸进行研究。取乙酸钠（Alfa Aesar）0、0.2 g 和0.5 g分别加入到上述（1.2.1）SRB溶液中，再分别加入0、0.4 mL 和4 mL 1 g·L-1腐植酸溶液（药品配制，购自Alfa Aesar）到上述（1.2.1）SRB 溶液中开展相应的微宇宙实验。取样和分析方法同上。上述所有实验均采用超纯水（18.25 MΩ）营养条件。

上述所有实验均设置3 组平行，微宇宙实验样品总量为216个。

1.3 亚硝酸盐对As氧化还原的影响

开展微宇宙实验进一步研究N 对As 形态变化的影响。在250 mL 三孔蓝盖瓶中加入196.76 mL 的超纯水和2 mL SRB 菌体溶液，参照1.2.1 部分避光厌氧培养后，将三孔蓝盖瓶放入恒温振荡箱以150 r·min-1在35 ℃的条件下振荡3 d。之后用针管抽取20 mL溶液用于检测初始N和As形态，再注入20 mL亚硝酸钠标准溶液（1 000 μg·mL-1）。再次将实验装置放入恒温振荡箱后，每1 h取6 mL样品溶液用于检测N和As形态，实验时间为5 h。

1.4 As和N的检测

As 价态及浓度测试采用氢化物发生原子荧光光谱高效液相色谱法，以7%HNO3（优级纯）为载流，20 g·L-1KBH4（优级纯）和5 g·L-1KOH（优级纯）混合作为还原剂，1.96 g·L-1（NH4）2HPO4（优级纯）作为流动相，高级氩气（0.3 MPa）作为载气[26]，用高效液相色谱原子荧光质谱仪（HPLC-AFS SAP50，北京吉天仪器有限公司）测试样品。采用国家标物中心提供的砷酸盐和亚砷酸盐标准溶液绘制标准曲线，其线性相关性为0.998。

2 结果与讨论

2.1 细菌活性对膨润土中N和As的影响

如图1所示，厌氧条件下，在膨润土-水溶液的体系中，As（Ⅴ）在SRB的生物还原作用下还原成As（Ⅲ），As（Ⅴ）浓度逐渐下降，As（Ⅲ）浓度逐渐升高。在标准培养液和寡营养体系中，As（Ⅲ）第0天就可以检测到，而控制组（超纯水）在第2 天之后才能检测出As（Ⅲ）。对比7 d 的As（Ⅲ）平均浓度，超纯水条件下As（Ⅲ）的平均浓度为668 μg·L-1，标准营养条件下的平均浓度为983 μg·L-1，表明在有利的营养生长环境下，SRB能更有效地促进As（Ⅴ）的还原。

图1 厌氧条件下不同SRB活性的膨润土中As形态的浓度变化Figure 1 Arsenic species transformation in the presence of bentonite under different culture of sulfate reducing bacteria

图2 厌氧条件下不同SRB活性的膨润土中N形态的浓度变化Figure 2 Nitrogen species transformation in the presence of bentonite under different culture of sulfating reducing bacteria

2.2 不同N添加量对As氧化还原的影响

如图3 所示，未添加硝酸钠的条件下，几乎检测不出As（Ⅲ），而As（Ⅴ）总量相对添加N 的实验组较低，这可能是受膨润土吸附的影响。有研究表明膨润土对氮肥和具有强烈的吸附效果，如果膨润土对N 的吸附接近饱和，则吸附的As 相对较少[29]。在低N（0.3 g NaNO3）条件下，As（Ⅲ）浓度由第2 天的0.81 μg·L-1逐渐升高至第7 天的427 μg·L-1。对比低N 条件，高N（1.2 g NaNO3）条件下As（Ⅲ）浓度升高的趋势更明显，且在第7 天时达到1 341 μg·L-1，约为第7 天低N条件As（Ⅲ）浓度的3倍。

图3 厌氧条件不同N含量膨润土中As的形态浓度变化Figure 3 Arsenic species transformation in the presence of bentonite under different nitrogen addition

在图4A 和图4B 中，低N 条件下NO-3和NO-2的平均浓度分别为120 mg·L-1和0.3 mg·L-1，分别约为高N条件的1/3（404 mg·L-1）和1/7（2.1 mg·L-1）。两种不同N 环境中的NH+4浓度变化波动较大，未观测出明显差异（图4C）。Al-Tamimi 等[30]曾用生物竞争排除（Bio-competitive exclusion，BCX）技术研究硝酸盐对SRB 产生的H2S 的影响，最终发现高浓度的硝酸盐可以有效抑制SRB 产生H2S。H2S 在厌氧条件下可以和As（Ⅴ）形成沉淀以达到去除As 的效果[31]，因此我们推测硝酸钠的加入使SRB 产生H2S 受阻，从而使得实验体系中的As（Ⅴ）和As（Ⅲ）浓度升高，且在一定范围内As（Ⅲ）浓度与所添加硝酸钠的量成正比。

图4 不同硝酸钠添加量条件下3种N形态浓度变化Figure 4 The change diagram of concentration of three nitrogen species under different sodium nitrogen addition

2.3 厌氧条件下不同乙酸钠添加量对膨润土中N、As形态的影响

乙酸钠是土壤中较为常见的小分子有机酸，Azelee 等[32]通过螯合法研究铜绿假单胞菌（Pseudomo-nas aeruginosa）中重金属的去除率，发现乙酸钠对As的去除率为59.50%。因此可以推测在细菌存在的厌氧体系下，乙酸钠的加入可以有效减少As 浓度。由图5 可看出，在含有乙酸钠的实验体系中，As（Ⅴ）的还原率明显高于未添加乙酸钠的控制组。在低乙酸钠（0.2 g）添加的条件下，As（Ⅲ）浓度从第3 天开始迅速升高，在第5 天达到最高浓度3 233 μg·L-1，为控制组（1 208 μg·L-1）的2.7 倍。与控制组相比，添加乙酸钠的条件下As（Ⅲ）浓度的升高，明显多于As（Ⅴ）浓度的减少，说明膨润土中吸附的As（Ⅴ）也被释放还原。这可能是因为醋酸盐等小分子有机酸可以作为电子穿梭体，在矿物表面的微生物C 源氧化和溶液As（Ⅴ）还原吸附之间穿梭，从而提高As（Ⅴ）的还原率。如图5B所示，在低乙酸钠添加的条件下，As（Ⅴ）浓度在第5天几乎接近于0 μg·L-1，说明SRB还原As（Ⅴ）的效率得到了极大的提高。高乙酸钠（0.5 g）添加使得实验体系中的As（Ⅴ）浓度升高，更多的As（Ⅴ）还原成As（Ⅲ），As（Ⅲ）在第5天的浓度为3 548 μg·L-1，是低乙酸钠条件下的1.1倍，且As（Ⅲ）浓度持续升高至实验结束。通过计算在低乙酸钠和高乙酸钠两种添加条件下求得的平均As（Ⅲ）浓度（1 370、1 663 μg·L-1）约为控制组（667 μg·L-1）的2.0倍和2.5倍。

图5 厌氧条件下不同乙酸钠添加量的膨润土中As形态的浓度变化Figure 5 Arsenic species transformation in the presence of bentonite under under different sodium acetate addition

图6 不同乙酸钠添加条件下3种N形态浓度变化Figure 6 The change diagram of concentration of three nitrogen species under different sodium acetate addition

2.4 厌氧条件下不同腐植酸添加量对膨润土中N、As形态的影响

腐植酸是农业土壤中常见且最具代表性的高分子有机物，也是影响土壤重金属形态和活性的关键组分[33]。如图7 所示，与控制组（无腐植酸）相比，加入腐植酸的实验组As（Ⅴ）还原成As（Ⅲ）的效率明显降低，随着腐植酸添加量的增多，实验体系中的As（Ⅴ）还原效果降低，总As 浓度也随之减小。在腐植酸浓度为0.002 g·L-1的环境下，As（Ⅲ）浓度在第3 天达到还原释放的最高浓度（1 150 μg·L-1），然后逐渐降低至0 μg·L-1，在4~7 d 时，As（Ⅴ）浓度有逐渐升高的趋势。当实验体系中的腐植酸浓度达到0.02 g·L-1时，As（Ⅲ）浓度达到最高浓度，但仅有181 μg·L-1，远低于控制组还原释放的As（Ⅲ）浓度（1 208 μg·L-1）。Ko等[34]研究了腐植酸对As 的吸附和解吸动力学的影响，发现腐植酸在As 的氧化还原反应中起到一定的作用，并且发现腐植酸的存在更有利于As的氧化。

图7 厌氧条件下不同腐植酸添加量的膨润土中As形态的浓度变化Figure 7 Arsenic species transformation in the presence of bentonite under different humic acid addition

图8 不同腐植酸添加条件下3种N形态浓度变化Figure 8 The change diagram of concentration of three nitrogen species under different humic acid addition

2.5 亚硝酸盐对As氧化还原的影响

综合分析不同SRB活性、外源N和乙酸钠的实验结果可以发现，当浓度较高时，As（Ⅲ）的浓度也在升高，以此推测和As（Ⅲ）之间可能存在一定的联系，为此开展了厌氧条件下亚硝酸盐对SRB 作用的As（Ⅴ）还原的影响。如图9所示，亚硝酸盐注入后的1 h内，其部分氧化成了，部分还原成了，As（Ⅲ）浓度达到了8.5 μg·L-1并逐渐升高，到实验结束的第5小时，As（Ⅲ）浓度升高至14.6 μg·L-1，说明的存在有可能促进As（Ⅴ）还原成As（Ⅲ）。结合图9 中浓度的降低和浓度的升高，推测得出以下方程式：

图9 添加亚硝酸盐后As(Ⅲ)和N浓度的变化Figure 9 Changes of As(Ⅲ)and nitrogen species concentration after adding nitrite

3 结论

（1）通过对比厌氧条件下不同营养条件膨润土固-液体系中N 和As的变化，得出最适合硫酸盐还原菌（Desulfovibrio vlugarisMiyazaki SRB）生长的条件，更有利于As（Ⅴ）还原生成As（Ⅲ），此时N 的浓度也维持在一个很高的水平，说明SRB 活性越强，还原生成的As（Ⅲ）浓度越高，对体系中的N也得到了固定。

（2）厌氧膨润土固-液体系中，外源N的添加明显促进了As（Ⅴ）的还原。在没有外源N 添加的控制组几乎检测不出As（Ⅲ），并且随着外源N 的增加，体系中成铵作用和反硝化作用也变得更加明显。

（3）大分子有机物腐植酸和小分子有机物乙酸钠对厌氧膨润土固-液体系中As（Ⅴ）的还原表现出不同的效果。在厌氧条件下，高乙酸钠添加的膨润土生成释放As（Ⅲ）的浓度约为未添加乙酸钠的膨润土的2.1倍，浓度也明显升高。而腐植酸的添加对As（Ⅴ）的还原起到了明显的抑制作用，促进了的生成。