HPLC法同时测定宫血停颗粒中六种成分的含量
2023-07-12胡生俊朱昱陈娟
胡生俊，朱昱，陈娟
宿迁市食品药品检验所，宿迁223800
宫血停颗粒是由黄芪、益母草、女贞子、升麻、枳壳、当归等11 味药材经水提醇沉工艺加工而成的中药复方制剂，具补益脾肾，活瘀止血的功效，用于脾肾两虚，气虚血瘀而致的月经过多及崩漏。崩漏是妇人在更年期及青春期均常见的疾病，临床治疗存在复发率高和副作用明显等特点，宫血停颗粒既有中药灵活多变的特点，而又服用方便，治疗妇人脾肾亏虚型崩漏疗效满意[1]。宫血停颗粒现行质量标准为《卫生部药品标准》中药成方制剂第十七册，检验项目仅有两项化学反应[2]，无法有效控制药品质量，且仅见HPLC-ELSD 法测定该药中黄芪甲苷含量的文献报道[3，4]。本文采用HPLC 法同时测定宫血停颗粒中毛蕊异黄酮葡萄糖苷、阿魏酸、异阿魏酸、特女贞苷、柚皮苷、新橙皮苷的含量，分别作为指标成分以反映处方中黄芪、当归、升麻、女贞子、枳壳5 味药材的质量及投料情况，结果表明该方法简便、准确、快速，稳定性和重现性良好，为宫血停颗粒质量标准的提高提供了实验依据。
1 仪器与试药
1.1 仪器
Thermo UltiMate3000 液相色谱仪（DAD 检测器）、Chromeleon7 色谱工作系统购自美国赛默飞公司、XPE205DR 电子天平（瑞士梅特勒-托利多集团）、Milli-Q 超纯水机（美国密理博公司）等。
1.2 试药
宫血停颗粒3 批（陕西步长高新制药有限公司，批号20220521、20220708、20221115）；毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品（批号111920-201907，纯度96.8%）、阿魏酸对照品（批号110773-201915，纯度99.4%）、异阿魏酸对照品（批号111698-201904，纯度99.3%）、特女贞苷对照品（批号111926-201906，纯度95.0%）、柚皮苷对照品（批号110722-202116，纯度93.5%）和新橙皮苷对照品（批号111857-201804，纯度99.4%）均购自中国食品药品检定研究院；甲醇、乙腈均为色谱纯（德国默克公司）；水为超纯水。
2 方法和结果
2.1 色谱条件
色谱柱Agilent TC-C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）；检测波长225 nm；以乙腈为流动相A，以0.5%磷酸溶液为流动相B，梯度洗脱（0～15 min，15% A；15～20 min，15%→20% A；20～25 min，20% A）；柱温35℃；流速1 mL·min-1；进样量：5 μL。
2.2 溶液的制备
2.2.1 对照品溶液 分别取毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品约14 mg、阿魏酸对照品约14 mg、异阿魏酸对照品约14 mg、特女贞苷对照品约46 mg、柚皮苷对照品约86 mg、新橙皮苷对照品约75 mg，精密称定，置100 mL 量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液。精密量取对照品贮备液2 mL，置20 mL 量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。
2.2.2 供试品溶液 取本品适量，研细，取约2 g，精密称定，置50 mL 量瓶中，加甲醇约40 mL，超声处理（功率300 W，频率45 kHz）30 min，放冷，加甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，续滤液即为供试品溶液。
2.2.3 阴性样品溶液 依照处方，分别制备不含黄芪、当归、升麻、女贞子、枳壳的阴性样品，再按“2.2.2”项下方法制备阴性样品溶液。
2.3 方法学验证[5]
2.3.1 系统适用性及专属性考察 分别取对照品溶液、供试品溶液和阴性样品溶液，按“2.1”项下的色谱条件进样，记录色谱图，见图1。结果表明，6 种成分峰的分离度均大于1.5，理论塔板数均大于8000。供试品色谱图种出现与对照品溶液中6 种成分保留时间一致的色谱峰，且相应的二极管阵列检测器（DAD）光谱也一致。阿魏酸作为当归和升麻共有成分[6]，在缺当归的阴性样品图1D 和缺升麻的阴性样品图1E 中均检出阿魏酸成分，其他阴性样品中在相应指标成分位置均未检出色谱峰，表明本法专属性良好。
图1 宫血停颗粒对照品溶液（A）、供试品溶液（B）、黄芪（C）、当归（D）、升麻（E）、女贞子（F）、枳壳（G）阴性样品溶液HPLC 色谱图
2.3.2 线性关系考察 分别精密量取“2.2.1”项下的对照品贮备液2 mL，分别置5、10、20、50、100、200 mL 量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。将上述6份系列浓度对照溶液按“2.1”项下的色谱条件进样，记录峰面积，以峰面积（Y，mAU*s）为纵坐标，浓度（X，μg·mL-1）为横坐标，进行线性回归，得到6 种成分的回归方程及线性范围（n=6），结果见表1。
表1 各成分线性关系
2.3.3 仪器精密度考察 取“2.2.1”项下对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样，重复进样6次，记录峰面积。结果显示，6 种成分的峰面积RSD 值分别为0.86%、1.05%、0.93%、0.57%、0.65%、0.37%（n=6），表明仪器精密度良好。
2.3.4 重复性考察 取同一批宫血停颗粒6份，按“2.2.2”项下方法平行制备6 份供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样，记录峰面积，采用外标法计算6 种成分的含量结果，结果显示，6 种成分的含量结果RSD 值分别为0.53%、0.47%、0.29%、0.66%、0.37%、0.41%（n=6）。三名实验人员分别对同一批宫血停颗粒进行含量测定，结果显示6 种成分的含量结果RSD值分别为1.24%、0.95%、0.83%、1.02%、0.29%、0.53%（n=3）。表明方法的重复性和中间精密度良好。
2.3.5 稳定性考察 取“2.2”项下的对照品溶液和供试品溶液，分别在0、2、4、8、12、24 h 按“2.1”项下的色谱条件进样，记录峰面积。结果显示，6 种成分的峰面积RSD 值均小于2.0%（n=6），表明各成分在24 h 内稳定性良好。
2.3.6 加样回收率考察 取已知含量的宫血停颗粒（批号20220521）6份，研细，精密称取1 g，置50 mL量瓶中，精密加入“2.2.1”项下对照品贮备液2.5 mL，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样，记录峰面积，用实测值与供试品含有量之差，除以对照品加入量计算各成分加样回收率和RSD（n=6），结果见表2。
表2 各成分加样回收率
2.3.7 耐用性考察 使用两种不同液相色谱仪（Thermo UltiMate3000、Agilent 1260II），三种不同品牌相同长度及填料的液相色谱柱（Agilent TCC18、Diamonsil C18、Supfex JX-C18），采用外标法对同一份样品中6 种成分进行含量测定，结果6 种成分的含量结果RSD 值均小于2.0%（n=6），各成分分离度均大于1.5。调节流动相初始比例（乙腈占比14%、15%、16%），磷酸溶液的浓度（0.05%、0.1%、0.5%、1.0%），各成分分离情况无明显变化，分离度均大于1.5，表明方法的耐用性良好。
2.4 样品测定
取三批宫血停颗粒，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样，记录各成分的峰面积，采用外标法，计算各成分含量，结果见表3。
表3 宫血停颗粒中各成分的含量（mg·g-1）
3 讨论
3.1 流动相的选择
实验过程中，分别考察了甲醇、乙腈作为有机相的流动相体系，结果显示，乙腈-0.5%磷酸溶液流动相体系使各成分分离效果最佳。乙腈-0.5%磷酸溶液（15∶85）亦能使各组分完全分离，但是新橙皮苷的出峰时间较迟且理论塔板数较低，因此选择本文中的梯度洗脱方法，使新橙皮苷出峰时间提前且理论塔板数更高。
3.2 检测波长的选择
使用DAD 检测器扫描对照品溶液色谱图，获得190～400 nm 各成分的光谱图（图2），考虑到目前国家药品标准中同一方法下少见多波长进行含量测定，且单一波长测定可以扩大方法适用性，故选定在225 nm 光谱下同时测定6 个成分的含量。
图2 毛蕊异黄酮葡萄糖苷（A）、阿魏酸（B）、异阿魏酸（C）、特女贞苷（D）、柚皮苷（E）及新橙皮苷（F）对照品光谱图
3.3 供试品溶液制备方法的确定
实验过程中，考察了提取溶剂的种类以及提取方法。分别比较了50%甲醇、甲醇、50%乙醇、乙醇作为提取溶剂，发现50%甲醇、甲醇的提取效果较好，但是由于样品中含有大量糖粉，50%甲醇制备的供试品溶液粘度大、难过滤，故选择甲醇作为提取溶剂[7]。分别比较了不同时间的超声提取和加热回流提取，发现二者提取效果相当，无显著性差异，但是超声处理更为便捷，故选择超声提取30 min 作为样品的提取方法。
3.4 检测成分的选择
《中国药典》2020 年一部中以黄芪中毛蕊异黄酮葡萄糖苷、当归中阿魏酸、升麻中异阿魏酸、女贞子中特女贞苷、枳壳中柚皮苷和新橙皮苷作为各药材的含量测定指标成分[6]，本文采用HPLC 法同时测定6 种成分以反映处方中黄芪、当归、升麻、女贞子、枳壳5 味药材的质量及投料情况。宫血停颗粒处方中益母草药材的指标成分为盐酸水苏碱，盐酸水苏碱在C18色谱柱保留较弱，通常采用SCX-强阳离子交换树脂柱进行分离，故本文未对益母草进行研究。
