结直肠癌组织中CDK1、IL-33表达及与其肿瘤恶性生物学行为的关系研究

向 前 韩玉超 李 闪

结直肠癌(CRC)是高发于结直肠内的消化道常见恶性肿瘤[1]。其发病机制复杂,在个体遗传易感性的基础上,由行为因素、环境以及生活方式等多种因素共同导致的结果[2-4]。细胞周期蛋白依赖性激酶1(CDK1)是真核细胞周期重要调控因子,可与细胞周期蛋白的结合驱动细胞周期进程[5]。白细胞介素-33(IL-33)属于白细胞介素-1家族,与多种消化道恶性肿瘤的发病机制密切相关[6]。既往研究表明,基因表达差异、慢性炎症状态与CRC肿瘤的增殖、转移以及侵袭密切相关[7-8]。但目前临床上关于CRC患者癌组织中CDK1、IL-33表达是否于不同组织中存在差异,且差异是否会影响CRC肿瘤恶性生物学行为临床研究较少。基于此,本文特探讨CRC患者癌组织中CDK1、IL-33表达与肿瘤恶性生物学行为的关系,以其明确CDK1、IL-33表达与肿瘤恶性生物学行为关系,为CRC诊断及治疗提供新思路,报告如下。

1 材料与方法

1.1 一般资料

选取2017年6月至2019年6月于我院进行就诊的CRC患者66例的病理组织标本。纳入标准:①病理组织确诊为CRC[9];②临床资料完整;③接受手术治疗前未进行CRC相关治疗。排除标准:①合并内分泌疾病;②合并其他恶性肿瘤;③患者精神异常。另选取66例患者中癌旁组织(距离癌组织边缘最短距离>5 cm)37例。

1.2 方法

研究标本经4%多聚甲醛固定液(北京康佳宏原生物科技有限公司)固定、石蜡包埋、4 μm厚度连续切片。应用免疫组织化学法进行染色,石蜡切片后依次放入二甲苯[国药锦奇(上海)化学试剂有限公司生产]中进行脱蜡,梯度无水乙醇水化(福州迈新公司生产),加3%双氧水(H2O2,福州迈新公司生产)溶液以灭活内源性过氧化物酶活性,再用磷酸缓冲盐溶液(PBS,福州迈新公司生产)冲洗三遍,每次3 min,用滤纸吸干切片组织周围PBS,加入一抗(CDK1抗体、IL-33抗体,纽普生物生产),让抗体充分将组织进行无气泡覆盖,置于4 ℃冰箱孵育过夜,次日拿出放置于室温下进行复温1 h,甩去一抗,PBS流动冲洗三遍,每次3 min。甩干PBS后,擦干组织,加入二抗(快捷型酶标羊抗鼠/兔IgG聚合物,纽普生物生产),让抗体充分将组织进行无气泡覆盖,放于湿盒内20 min,PBS流动冲洗三遍,每次3 min。滴加DAB染色液(蒸馏水0.85 mL,依次加入A、B、C液各50 μl,充分进行混匀,福州迈新公司生产),使组织被充分覆盖,放于显微镜下观察显色反应,显色反应完成后用自来水冲洗组织1 min,将切片置入苏木精染液(上海恒远生物生产)2 min,自来水冲洗30 s;放入1%的盐酸酒精分化数秒,再放入流水下冲洗30 s;氨水返蓝30 s,再用流水冲洗30 s,再将切片依次放入95%酒精-无水乙醇-二苯甲各5 min,进行脱水封片。胞质和(或)胞核中发现棕黄色或者黄褐色颗粒则表示细胞染色阳性,再于光学显微镜下随机选取高倍视野(400倍)观察每张切片,并计数细胞500个,依据阳性细胞占比不同分为以下五类等级:0分,阳性细胞占比<5%;1分,阳性细胞占比5%～25%;2分,阳性细胞占比26%～50%;3分,阳性细胞占比51%～75%;4分,阳性细胞占比76%～100%。根据着色强度再进行半定量判定,评分标准:不着色为0分;着色弱(淡黄色)为1分;中等着色(黄色)为2分;强着色(棕褐色)为3分。免疫反应的得分=阳性细胞的占比得分×免疫染色强度得分:阴性表达两者乘积为0分,免疫组织化学反应(-);弱阳性表达两者乘积为1～4分(+),中度阳性表达两者乘积为5～8分(++),强阳性表达两者乘积为9～12分(+++)。IL-33抗原阳性反应为细胞胞质中观察到有黄色颗粒,与背景颜色比较,无色计0分、淡黄色计1分、黄颜色计2分及棕褐色计3分;阳性细胞占比评分:显微镜下随机选取10个代表性视野计算阳性表达率,阳性表达率<5%(-,0分)、5%～25%(+,1分)、26%～50% (++,2分)和>50%(+++,3分),本研究中将“-～+”视为低表达,“++～+++”视为高表达。阴性对照用PBS标本,阳性对照用实验室已知阳性标本。

基于上述现状，提出的改善思路为：在深南大道主辅路汇入点设置预信号，实现辅道进入交通主路节点联动组织，改善城市干道节点通行能力. 当主线预信号红灯亮起时，辅路的预信号绿灯亮起，辅路车辆可快速进入左转、掉头车道，避免冲突.

1.3 随访

指定一名护士通过患者门诊复诊、电话或微信随访方式对患者及其家属进行为期3年随访,以掌握患者CRC复发、转移及生存情况,随访的截止日期为2022年6月,并统计CRC患者无进展生存期(PFS),其中PFS为患者术后至第一次发生CRC疾病进展或死亡时间[10]。

1.4 统计学方法

CRC是一种消化道恶性肿瘤,可严重威胁人类生存健康,据近几年流行病学调查资料显示,其发病率正呈明显上升趋势,且趋于年轻化[11]。其中手术切除是CRC优选的治疗方法,术后患者5年生存率可达90%以上,但如果合并远处转移,患者生存率则会显著降低[12-13]。因此,CRC的早期筛查、早期诊断是治疗CRC的关键。

2 结果

2.1 CDK1、IL-33在CRC组织与癌旁组织中表达差异对比

军队能执行，因为要求虽然简洁，但抓住了根本，只要简单的条款做到了，其他要求也就做到；企业员工难执行，是因为要求太多了，不一定抓到要害，规定太多，做到这条，违了那条，久而久之，难以坚持。

CDK1、IL-33在CRC组织中表达水平均高于癌旁组织(P<0.05),见表1。

表1 CDK1、IL-33在CRC组织与癌旁组织中表达差异对比(例,%)

2.2 CDK1、IL-33表达与CRC临床病理特征的关系

截止2022年6月,CDK1高表达患者无进展生存期(PFS)为33.58个月,短于CDK1低表达患者35.12个月(logRankχ2=5.627,P<0.05),IL-33高表达患者PFS为33.95个月,短于IL-33低表达患者35.64个月(logRankχ2=4.696,P<0.05),见图1、2。

冰醋酸(CH3COOH)、硝酸(HNO3)、盐酸(HCl)、氢氧化钾(KOH)、氢氧化钠(NaOH)、碳酸钠(NaCO3)、硝酸铁(Fe(NO3)3)、邻苯二甲酸氢钾(C8H5KO4)、四氯化碳(CCl4)、无水乙酸铜(Cu2(CH3COO)4)、吡啶(C5H5N)、硫酸铜(CuSO4)、硫酸铅(PbSO4)均为分析纯。

表2 CDK1、IL-33表达与CRC临床病理特征的关系(例,%)

2.3 不同CDK1、IL-33表达水平患者PFS对比

低分化、淋巴结转移以及TNM分期高的CRC患者肿瘤组织中CDK1、IL-33表达水平越高(P<0.05),见表2。

图1 不同CDK1表达水平PFS图

图2 不同IL-33表达水平PFS图

2.4 多因素分析

在66例CRC组织中,CDK1高表达率为59.09%(39/66),IL-33高表达率为68.18%(45/66),其中IL-33高表达同时CDK1高表达36例,两者表达情况呈正相关(P<0.05),见表4。

表3 多因素分析

2.5 CDK1与IL-33表达的相关性

CDK1高表达、IL-33高表达、肿瘤细胞低分化、淋巴结转移以及TNM分期Ⅲ期均是患者病情进展的危险因素(P<0.05),见表3。

表4 CDK1表达与IL-33表达的相关性/例

3 讨论

应用SPSS 22.0版软件对数据进行统计学分析,计数资料(%),采用卡方检验;相关性分析应用Spearman秩相关性检验;P<0.05,数据间差异存在统计学意义。应用GraphPad Prism5.0软件、Kaplan-Meier生存曲线分析CDK1、IL-33与CRC患者3年PFS的相关性,选用Log-rank法,检验标准P<0.05。

本研究显示,CRC肿瘤细胞分化程度、淋巴结转移以及TNM分期中CDK1、IL-33表达水平存在差异,且肿瘤细胞低分化、伴淋巴结转移以及TNM分期越高,肿瘤组织中CDK1、IL-33表达水平越高,其PFS则相对较短,说明CDK1、IL-33表达与肿瘤恶性生物学行为可能存在关联。分析原因可能为:CDK1可调控真核细胞有丝分裂细胞周期G1/S和G2/M期,与CRC的发生、进展以及预后情况息息相关,在多种肿瘤细胞中CDK1表达失调呈现出过度表达状态,能直接导致人体细胞周期生理过程出现紊乱,细胞分化过程发生障碍,促进CRC细胞的恶性增殖与转化[14-15]。而细胞白介素在机体免疫反应调节与细胞活化增殖环节中发挥着重要作用,其中IL-33为白介素家族中主要的促进癌变因子,可与其受体蛋白ST2结合活化核转录因子κB与促分裂原活化蛋白激酶,以及信号通路上调环氧化酶2分泌和通过前列腺素E2途径改变巨噬细胞浸润与极化,从而调节基因转录,重塑肿瘤微环境,继而促进CRC侵袭与远处转移[16-17];这均进一步提示CDK1、IL-33表达情况与CRC疾病进展密切相关,当二者在患者CRC组织中表达水平上调时,预示患者肿瘤组织恶性程度越高,更易转移且易发生预后不良,PFS进一步缩短[18-19]。

本研究还发现,CDK1与IL-33表达呈正相关,说明CDK1与IL-33表达相互影响。分析原因可能为,IL-33参与机体炎症、感染以及免疫反应等多种生物学活动,其可通过激活过磷酸化p38丝裂原活化蛋白激酶信号通路,有效抑制细胞线粒体凋亡通路,维持肿瘤细胞存活机制,减弱肿瘤细胞自我凋亡能力,从而促进CDK1显著表达,进而影响细胞周期进程,使细胞周期由G2/M检验点向异常M期方向推进,促进CRC肿瘤细胞异常增殖与转化[20]。

铝土矿中w(SiO2)≥10%，换算得到w(Si)≥4.67%，试液中的硅主要以石英态和可溶性硅酸盐形式存在，石英态形式存在的二氧化硅在盐酸溶解过程中不参与反应，而以可溶性硅酸盐形式存在的硅会与钙结合生成不溶性的硅酸钙，在溶解过滤过程中可被有效地去除，因此硅不会干扰硫酸根的测定。

综上,CRC患者癌组织中CDK1、IL-33在CRC组织中存在异常高表达,二者与肿瘤恶性生物学行为密切相关,且二者表达存在相关性。