miR-627-3p并发靶向STK11/KEAP1调控肺腺癌的铁死亡研究

张苗苗 田君娜 孙颖颖

肺癌是癌症相关死亡的主要原因,是全球和中国最常见的癌症,导致 2015 年超过 280 万人死亡,其中约 40% 涉及肺腺癌 (ADCs)[1]。肺癌分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌(NSCLC),包括ADC和鳞状细胞癌(SCC),分别占所有肺癌病例的80%～85%[2]。microRNA (miRNA) 通过降解或抑制靶 mRNA 在转录后水平调节基因表达在肺腺癌发展和进展中具有重要作用[3]。此外,现在已知许多 miRNA与癌症的发展和进展密切相关[4]。因此,在了解肺腺癌的分子机制以识别新的预后分子标志物方面面临着巨大的挑战,这些标志物可以促进在肺癌发展早期制定适当的治疗策略。细胞代谢的重编程,包括凋亡和坏死细胞死亡的调节,是肿瘤发生所必需的[5]。铁死亡是一种新发现的非凋亡性细胞死亡模式,涉及代谢功能障碍,导致细胞内代谢过程谷氨酰胺分解和铁依赖性活性氧 (ROS)、铁载体蛋白转铁蛋白和线粒体超氧化物的产生,以及膜电位减少和其他相关调节剂的形成[6]。铁死亡水平异常与肿瘤发生发展密切相关[7]。基于此,本研究通过miRNA微阵列和体外细胞实验分析肺腺癌组织和癌旁组织中的差异miRNA对人肺腺癌细胞Calu-3铁死亡水平的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

纳入2019年1月至2021年12月我院收治的肺腺癌患者126例,其中男性75例,女性51例,平均年龄(51.23±22.59)岁。所有患者均经过我院病理科诊断并确诊为肺腺癌,并且均签署知情同意书且本研究获得我院的伦理委员会批准。收集患者治疗前的肺腺癌组织和癌旁组织后保存于液氮中。

miRvana总RNA分离试剂盒购自艾德科技公司(货号:AM1561)。GAPDH、STK11、KEAP1抗体购自abcam公司(货号:ab8245、ab15095、ab227828)。本研究所有的siRNA、miR-627-3p mimics、miR-627-3p inhibitor、STK11和KEAP1过表达质粒均由北京睿博设计合成。人肺腺癌细胞Calu-3购自广州群贤科技有限公司(货号:CTCC-003-0104)。PrimeScript RT Master Mix Kit购自广州翔博生物科技有限公司(货号:RR036A)。DCFH-DA购自北京依珊汇通科技有限公司(货号:D837204-50mg)。C11-BODIPY自深圳市益百顺科技有限公司(货号:GC40165-1mg)。pMIR-REPORT购自深圳市益百顺科技有限公司(货号:P0471)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与处理 人肺腺癌细胞Calu-3在添加10% FBS的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)中培养,并将其置于37 ℃、5% CO2的恒温培养箱中。

1.2.2 RNA抽取与实时荧光定量PCR 使用miRvana总RNA分离试剂盒分离总RNA,并根据制造商的说明使用NanoDrop分光光度计进行定量。然后将样品储存在-80 ℃直至使用。使用PrimeScript RT Master Mix Ki合成cDNA。采用Stem-Loop RT-PCR测定法检测miR-627-3p的表达。简而言之,使用实时PCR通用试剂和MX3000P实时PCR仪器根据制造商的说明进行实时PCR。PCR方案需要35个循环,即94 ℃ 1 min、55 ℃ 1 min和72 ℃ 1 min,然后在72 ℃延伸5 min。 将细胞和组织中的RNA水平标准化为U6 snRNA或GAPDH的水平。

1.2.3 MiRNA微阵列分析 使用安捷miRNA微阵列分析服务从三份肺腺癌组织和癌旁组织中检测miRNA表达谱。

1.2.4 细胞增殖水平的测定 MTT法检测Calu-3细胞的增殖水平。用miR-627-3p mimics或inhibitor转染24 h后,将细胞以2×103个细胞/孔的密度接种到96孔板中。将10 μL等分的MTT添加到每个孔中并孵育2 h,然后使用酶标仪测量490 nm处的光密度。

1.2.5 细胞铁死亡水平的测定 Lipid-ROS水平为铁死亡指标之一。不同处理后,将Calu-3细胞与10 μM DCFH-DA或5 μM C11-BODIPY无血清培养基中于37 ℃孵育30 min。然后用PBS洗涤细胞。使用用于DCFH-DA荧光素检测的519 nm滤光片和用于C11-BODIPY检测的617 nm滤光片在流式细胞仪上分析ROS水平。

1.2.6 免疫印迹 为了评估蛋白质表达,在裂解缓冲液中从 1×106个Calu-3细胞样品制备全细胞裂解物,然后在10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离含有60 μg蛋白质的等分试样并电转移到PVDF膜。然后在室温下用含5%脱脂奶粉的TBST封闭膜1小时,并在4 ℃下与GAPDH抗体或STK11抗体或KEAP1抗体孵育过夜。随后,将膜与HRP偶联的二抗在室温下孵育1小时。然后使用ECL试剂盒检测蛋白表达水平。

1.2.7 荧光素酶报告实验 PCR扩增STK11或KEAP1 3'-UTR并克隆到pMIR-REPORTTM载体中。使用Lipofectamine 2000将50 ng pluc-3'UTR(WT 或 MT)、10 ng海肾萤光素酶、5 pmol miR-627-3p mimics和阴性对照的混合物共转染到Calu-3细胞中。48 h后,使用双荧光素酶报告分析系统分析荧光素酶活性。

1.3 统计学分析

本研究使用R软件(版本:4.1.5)进行统计分析。非配对学生t检验检查组间差异的统计显著性。所有实验至少重复3次。对于多重比较,使用单因素方差分析,然后进行 LSD 事后检验。

2 结果

2.1 肺腺癌组织中miR-627-3p高表达患者的生存情况

将126例患者的肺腺癌组织和癌旁组织各取33份混合在一起,随后进行miRNA微阵列分析,发现有27种miRNA变化显著,其中14种miRNA在肺腺癌组织中表达下调,13种miRNA在肺腺癌组织中表达上调。按照miRNA在肺腺癌组织中的平均表达水平,将126例患者分为miRNA低表达组和miRNA高表达组。发现miR-627-3p高表达的肺腺癌患者生存率优于miR-627-3p低表达的肺腺癌患者(P<0.05),见图1。

图1 肺腺癌组织中miR-627-3p表达患者总生存期

2.2 miR-627-3p调控肺腺癌细胞的铁死亡

过表达miR-627-3p后,肺腺癌细胞Calu-3的细胞增殖水平下降(P<0.05),铁死亡水平上升(P<0.05);敲低miR-627-3p后,肺腺癌细胞Calu-3的细胞增殖水平上升(P<0.05),铁死亡水平下降(P<0.05),见图2。

图2 miR-627-3p调控肺腺癌细胞的铁死亡

2.3 miR-627-3p并发靶向STK11/KEAP1发挥生物学功能

使用miRDB数据库分析miR-627-3p发挥生物学功能的潜在底物,选取评分最高的60个基因进行siRNA敲低筛选。敲低STK11或KEAP1时肺腺癌细胞Calu-3的细胞增殖水平下降(P<0.05)、铁死亡水平上升(P<0.05);过表达STK11或KEAP1时肺腺癌细胞Calu-3的细胞增殖水平上升(P<0.05)、铁死亡水平下降(P<0.05),见图3A～图3C。预测STK11或KEAP1的miR-627-3p结合位点均位于3'端非翻译区。过表达miR-627-3p后,肺腺癌细胞Calu-3中STK11或KEAP1的mRNA和蛋白水平下降;敲低miR-627-3p后,肺腺癌细胞Calu-3中STK11或KEAP1的mRNA和蛋白水平上升,见图3D～图3F。将预测结合位点突变后,miR-627-3p无法结合STK11或KEAP1的3'端非翻译区,见图3G。

图3 miR-627-3p并发靶向STK11/KEAP1发挥生物学功能

3 讨论

肺腺癌是全球肿瘤相关死亡的主要原因,在过去几十年中发病率稳步上升[8]。因此,在了解肺腺癌的分子机制以识别新的预后分子标志物方面面临着巨大的挑战,这些标志物可以促进在肺癌发展早期制定适当的治疗策略。本研究发现miR-627-3p高表达的肺腺癌患者生存率优于miR-627-3p低表达的肺腺癌患者。因此,miR-627-3p可以成为肺腺癌患者预后的潜在标志物。

最近发现程序性坏死的铁死亡模式是一种不依赖细胞凋亡的细胞死亡形式[9]。铁死亡的特征在于脂质 ROS 的铁依赖性致死性积累[10]。miRNA介导中间代谢产物的感知,以调节基因调控和疾病进展,包括癌症[11]。然而,miRNA与铁死亡之间的联系仍不清楚。本研究证明miR-627-3p可以减少脂质ROS,减少了肺腺癌细胞铁死亡水平。

最近研究发现STK11和KEAP1与SCD1的表达存在相关性[12]。SCD1是1种已知的铁死亡调节剂[13]。SCD1 的转录调控尚不完全清楚;然而,启动子区域包含几个众所周知的转录因子的转录因子结合位点,包括 NF-1、AP-2、SREBP 和 PPAR[14]。STK11是1种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,能够磷酸化多种转录因子并促使转录因子核转移进行相关基因的转录[15]。KEAP1是1种泛素E3连接酶,能够通过泛素化调控多种转录因子入核[16]。因此,STK11和KEAP1可能对SCD1的关键转录因子进行了修饰,改变了SCD1的转录表达,改变了细胞的铁死亡水平。本研究结果首次表明miR-627-3p通过与 STK11和KEAP1相互作用在癌变过程中充当重要的铁死亡抑制剂,miR-627-3p是1种新型的铁死亡调节因子。

肺腺癌的靶向治疗已在一部分肿瘤患者中取得成功,这些患者携带一些单一驱动突变,最显着的是导致致癌激酶激活的突变[17]。因此,这种方法不能为肿瘤具有更复杂的肿瘤突变谱的患者提供治疗策略,包括STK11和KEAP1突变[12]。鉴于基因的翻译区突变改变了蛋白质的构象减少了靶向治疗的效果,靶向治疗的关注点可以从蛋白水平转移到核酸水平,比如STK11和KEAP1的非翻译区。

综上所述,miR-627-3p作为抑癌因子发挥作用,以STK11 和 KEAP1依赖性方式抑制肿瘤细胞增殖、促进铁死亡。这些发现表明miR-627-3p是肿瘤进展的关键分子,可作为肺腺癌治疗的有效靶点。