甲状腺切除术对甲状腺癌荷瘤小鼠的免疫应答反应的影响

李娜娜 陈园园

甲状腺癌是临床较为常见的内分泌肿瘤之一[1],分化型甲状腺癌占甲状腺癌的80%～85%[2]。目前对于甲状腺癌患者的治疗通常采取甲状腺全切手术进行治疗。研究显示[3],甲状腺癌病灶部位的切除对周边细胞的增生具有显著的抑制性作用。而在周围细胞的抑制作用中,多种免疫细胞、生长因子以及凋亡因子的相互作用发挥关键作用。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF) 主要存在于癌细胞以及血管内皮细胞中,在甲状腺癌的疾病进展中,VEGF主要是由甲状腺癌细胞产生,并向细胞外进行分泌[4],同时与血管内皮细胞受体相互结合促进周围细胞的增生。在肿瘤的进展过程中,慢性炎性反应参与了甲状腺癌细胞的增殖、凋亡[5]。有研究推测认为[6],可溶性受体Fas(sFas)以及可溶性受体配体(sFasL)通过对机体免疫功能的显著性抑制性作用,抑制癌细胞对机体免疫功能的逃逸作用。本研究主要通过甲状腺切除术对甲状腺癌荷瘤小鼠的免疫应答反应的影响分析,为临床治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

本研究仪器主要采取酶标仪(DNM-9602,北京普朗新技术有限公司)、冷冻离心机(TGL20M,JTLIANGYOU);恒温水浴箱(HH-W420/W600)进行试验。实验小鼠的免疫细胞分析采用流式细胞仪(Moflo XDP型,贝克曼)进行分析,机体的炎性因子分析采用酶标仪进行,sFas、sFasL、VEGF采用western blot方法进行检测。所有试剂均来自上海罗氏,操作流程严格按照说明书进行。

1.2 实验动物

本研究采用由中科院提供的雄性SPF级新生小鼠60只(合格证号为20170516),体重180～217 g,平均体重为(213.33±2.39)g,室温控制在(21±2)℃,湿度30%～70%,光照每昼夜12 h。

1.3 模型构建与干预方法

模型组:采取40只以上小鼠进行模型制备,采用含有10%的胎牛血清培养液(WE)对肿瘤细胞进行培养,肿瘤细胞来自中科院上海细胞库的甲状腺癌TT细胞株,培养完成后,将以上细胞接种于培养瓶中,在室温37 ℃以及含有5% CO2的孵育箱中进行培养,培养时间为6～7天,在培养瓶中,肿瘤细胞在瓶底长满后,使用0.25%的胰酶对以上细胞进行消化并离心。采用磷酸盐缓冲液制备肿瘤细胞悬液,肿瘤细胞悬液的浓度调整为2.0×107/ml,对模型组实验小鼠在颈背部进行皮下注射,注射剂量为100 μL。每两日对实验小鼠的体重进行称重,并对肿瘤长径以及短径进行测量,计算肿瘤的体积。肿瘤体积达到80 mm3后开展后续实验。

手术组:挑选模型组中20只小鼠喂养8周后进行甲状腺全切除手术。

对照组:对实验小鼠20只进行颈背部注射生理盐水100 μL。

1.4 标本处理与观察项目

1.4.1 sFas、sFasL、VEGF水平检测 对3组小鼠的甲状腺细胞进行处理后,弃去培养基,使用等量的磷酸盐缓冲液对以上细胞进行冲洗2次,彻底清除残留的培养基。使用十二烷基硫酸钠样品缓冲液进行冲洗,去除细胞,同时对将以上溶液转移至EP管中,使用沸水煮沸5 min,采用凝胶电泳法(SDS聚丙烯酰胺)进行电泳,在聚偏氟乙烯进行转印,使用封闭液(0.1 ml/cm2)进行封闭1 h,在一抗作用下进行过夜,过夜温度为4 ℃。将以上转移槽在冰浴中进行添加转移缓冲液,在100 V电流作用1 h,使用25 ml的TBS 进行洗膜5 min,加入适量的辣根过氧化酶标记物标记的二抗进行室温孵育1 h。使用显色法对sFas、sFasL、VEGF水平检测。

1.4.2 炎性因子水平比较 分别对3组小鼠进行静脉采血3 ml,5000 r/min离心15 min后,分离血清,采用放射免疫分析法对肿瘤坏死因子(TNF-α)、白介素1β(IL-1β)以及白介素6(IL-6)水平进行分析。

1.4.3 T细胞以及B细胞的增殖活性比较 取出3组小鼠的脾脏,并进行称重,计算3组小鼠的脾指数(SI)。SI=脾重(mg)/体重(g)。计算脾指数后,在无菌状态下制作淋巴细胞单细胞悬液,计数后,将以上细胞悬液接种于96孔的板中,使用20 mg/ml的脂多糖进行刺激,48 h后对以上细胞悬液进行细胞毒性试验,使用酶标仪对小鼠的脾脏T细胞以及B细胞的增殖活性进行测定。

1.4.4 免疫细胞水平比较 采用流式细胞仪对3组小鼠的血浆进行检测,比较3组小鼠的CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、调节性T细胞(Treg)、髓源性抑制细胞(Myeloid-derived suppressor cells,MDSC)、自然杀伤性细胞(natural killer cell,NK)、B细胞水平。

1.5 统计学方法

采用SPSS 26.0软件进行统计学分析,所有计量资料均符合正态分布,采用独立样本t检验进行对比。多组比较,采用方差分析,两两比较,采用LSD-t检验;计数资料以[n(%)]表示,采用卡方检验分析。P<0.05说明差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 sFas、sFasL、VEGF水平比较

3组小鼠sFas(F=11.231,P=0.000)、sFasL(F=6.672,P=0.000)、VEGF(F=12.231,P=0.000)之间的差异存在统计学意义,通过两两比较,3组小鼠的sFas、sFasL、VEGF水平从高到低依次为模型组、手术组以及对照组。详见表1、图1。

图1 3组sFas、sFasL、VEGF水平比较

表1 3组小鼠sFas、sFasL、VEGF水平比较

2.2 炎性因子水平比较

3组小鼠的TNF-α(F=11.549,P=0.000)、IL-1β(F=12.598,P=0.000)、IL-6(F=8.997,P=0.000)之间的差异存在统计学意义,通过两两比较,3组小鼠的炎性因子水平从高到低依次为模型组、手术组以及对照组,详见表2。

表2 3组炎性因子水平比较

2.3 T细胞以及B细胞的增殖活性比较

3组小鼠的SI(F=7.006,P=0.000)、T细胞增殖活性(F=6.111,P=0.000)、B细胞增殖活性(F=8.098,P=0.000)之间的差异存在统计学意义,经过两两比较,3组小鼠的SI、T细胞增殖活性、B细胞增殖活性从高到低依次为对照组、手术组以及模型组,详见表3。

表3 3组T细胞以及B细胞的增殖活性比较

2.4 免疫细胞水平比较

3组小鼠的CD3+T细胞、CD8+T细胞、Treg、NK之间的差异不存在统计学意义(P>0.05),3组小鼠的CD4+T细胞(F=12.090,P=0.000)、CD4+/CD8+(F=12.443,P=0.000)、MDSC(F=12.112,P=0.000)、B细胞比例(F=12.145,P=0.000)之间的差异存在统计学意义,通过两两比较,CD4+T细胞、CD4+/CD8+、B细胞比例从高到低依次为对照组、手术组以及模型组,MDSC从高到低依次为模型组、手术组以及对照组,详见表4。

表4 3组免疫细胞水平比较

3 讨论

甲状腺癌是临床较为常见的恶性肿瘤之一[7],目前对于甲状腺癌的治疗主要采取手术,手术治疗效果已经明确。但是关于手术治疗后机体的细胞凋亡以及新生血管的抑制机制尚不明确[8],通过对以上机制的分析,对于日后甲状腺癌复发以及治疗效果的评价具有重要价值。

在甲状腺癌细胞的进展过程中,机体的甲状腺组织细胞发生显著的变化,甲状腺周边细胞的增生能力显著升高,平滑肌显著肥大,新生血管的形成能力显著升高[9]。通过对甲状腺模型实验小鼠的手术切除,相比模型组,手术组小鼠的sFas、sFasL、VEGF水平显著下降,分析认为,在甲状腺癌的模型制备成功后,会刺激实验小鼠大量分泌缺氧诱导因子1α[10],该因子对于VEGF转录以及表达具有显著的意义,进而参与了肿瘤进展。而作为凋亡因子水平sFas、sFasL的显著下降,也反映了机体的正常细胞以及免疫细胞的凋亡水平下降[11],对于机体的恢复具有重要意义。在实验小鼠进行甲状腺全切手术后,炎性因子水平显著下调,提示,对实验小鼠的肿瘤组织进行切除后,肿瘤组织分泌物质造成的内环境被破坏[12],对正常细胞的炎性反应具有显著的下调作用。李亚南等通过对实验大鼠的甲状腺癌组织进行切除后,实验小鼠的生长因子以及凋亡因子显著下调,与本研究相互印证[13]。

而在对实验小鼠的免疫细胞活性以及相关免疫细胞的水平分析中,随着手术的进行,手术组实验小鼠的T细胞以及B细胞的增殖活性显著恢复,CD4+T细胞、CD4+/CD8+、MDSC、B细胞比例显著回升。研究认为,在肿瘤细胞的进展过程中,机体的免疫监视以及攻击作用一直存在,但是,随着肿瘤细胞的进一步发展,导致机体免疫细胞的增殖活性下降,进而导致肿瘤细胞的免疫逃逸能力的显著上升[14]。CD4+介导的免疫调节作用可显著促进CD8+以及B细胞的增殖,进而提升机体的免疫应答水平,而在本研究中,相比模型组,手术组实验小鼠的CD4+T细胞、CD4+/CD8+均显著上升,而CD8+水平未见显著异常改变。提示,对实验小鼠的甲状腺癌组织的切除,可促使正常细胞以及免疫细胞的抑制作用显著下降,CD4+显著回升[15]。另外,在对实验小鼠的MDSC、B细胞比例水平的分析中,相比模型组,手术组实验小鼠的MDSC、B细胞比例显著提高,分析认为,MDSC的累积作用是造成免疫抑制的主要原因,在多种肿瘤细胞的研究中已经证实,MDSC与肿瘤对免疫细胞的逃逸作用显著相关,而在本研究中在对荷瘤小鼠进行甲状腺组织的切除后,MDSC显著下降。

综上所述,甲状腺癌荷瘤小鼠进行甲状腺手术全切后,可能通过上调CD4+T细胞、CD4+/CD8+、B细胞水平,下调MDSC水平,进而抑制肿瘤细胞的免疫逃逸作用。