eIF4E3与肝细胞癌患者预后的关联性及其作用机制分析

祖 玲, 李万里, 刘天奇

原发性肝癌是全球常见的肿瘤之一,在所有癌症中其发病率和病死率分别排在第6位和第3位[1]。原发性肝癌主要包括肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)和肝内胆管癌两种类型,其中HCC占75%～85%[2],是肝癌患者的主要死亡原因[3]。由于HCC的瘤内异质性和耐药性[4],患者可用的治疗方法有限,预后往往不理想,5年生存率约为18.4%[5-6]。因此,迫切需要探索更有效的治疗靶点来改善HCC患者的生存预后。有研究表明,用真核翻译起始因子4E家族成员3(eukaryotic translation initiation factor 4E family member 3,eIF4E3)、GEMIN5和NCBP2基因构建的N7-甲基腺苷风险评分(m7G Risk Score,MRS)可用于评估大肠癌患者的预后情况,低MRS组表现出更好的免疫活性,对免疫治疗的反应更好[7]。eIF4E3是真核翻译起始因子,位于细胞核和细胞质中,支持mRNA的输出和翻译。既往研究表明,eIF4E3在急性髓系白血病、头颈部鳞状细胞癌中起抑癌作用[8]。也有研究发现eIF4E3可以阻碍致癌转化,并在某些癌症中表达缺失,这一机制可能具有重要的生物学和临床意义[9]。但是,目前关于eIF4E3与HCC发生、发展关联性的研究较少。鉴此,本研究旨在探讨eIF4E3在HCC中的表达水平,分析其与预后、肿瘤免疫微环境的关联性,并通过不同数据库进行交叉验证,为eIF4E3作为HCC的治疗靶点和生物标志物提供理论依据。

1 资料与方法

1.1数据采集 以公共数据库数据和生信分析的网页工具为基础开展研究。以“HCC”“transcriptome profiling”“gene expression quantification”为关键词进行检索,得到TCGA-HCC数据集,其中包含正常肝脏组织和HCC组织的基因表达数据,以及标本来源患者的临床资料。生存数据缺失的样本不纳入生存分析。

1.2eIF4E3的表达及其与预后的关联分析 应用肿瘤免疫评估资源(Tumor Immune Estimate Resource,TIMER)数据库(https://cistrome.shinyapps.io/timer/)探索eIF4E3在不同肿瘤与正常组织的表达差异[10]。应用癌症基因集分析(Gene Set Cancer Analysis,GSCA)数据库[11](http://bioinfo.life.hust.edu.cn/GSCA)、肝细胞癌整合分子数据库(Hepatocellular Carcinoma Database,HCCDB)[12](http://lifeome.net/database/hccdb/search.html)和UALCAN数据库[13](http://ualcan.path.uab.edu)分析eIF4E3在HCC组织和正常肝组织中转录水平和蛋白质表达水平的差异。应用UALCAN数据库分析eIF4E3表达情况与HCC临床病理特征的关联性。应用GSCA的生存分析模块和Kaplan-Meier Plotter数据库[14](http://kmplot.com/analysis/)进行生存分析。

1.3共表达网络构建及功能富集分析 应用Linked Omics数据库[15](http://www.linkedomics.org/login.php)鉴定eIF4E3共表达基因。以P<0.01、R>|0.4|作为筛选标准,将所得到的共表达基因通过Linked Omics数据库的基因富集分析模块和Sanger Box生物信息分析平台(http://sangerbox.com/Tool)进行基因本体论(Gene Ontology,GO)分析和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)分析,探索eIF4E3共表达基因的主要功能。

1.4免疫渗透分析 通过肿瘤免疫相互作用数据库(Tumor-Immune System Interactions Database,TISIDB)(http://cis.hku.hk/TISIDB/index.php)探讨eIF4E3表达与HCC免疫亚型及免疫细胞浸润丰度的关联性[16]。应用Sanger Box生物信息分析平台的CIBERSORT算法探索HCC中eIF4E3表达情况与22种免疫细胞浸润的相关性[17-18]。通过Estimate算法进一步预测肿瘤微环境(tumor microenvironment,TME)中的肿瘤纯度,包括间质评分(捕获肿瘤组织中间质的存在)、免疫评分(代表免疫细胞在肿瘤组织中的渗透程度)和估计评分(推断肿瘤纯度)[19]。通过免疫表观评分(immune phenotype score,IPS)模块探索HCC中eIF4E3表达与IPS的关系。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1eIF4E3在HCC组织中的表达情况 基于TIMER数据库资料的分析结果显示,eIF4E3 mRNA在HCC、膀胱尿路上皮癌、乳腺浸润癌、结肠癌、头颈鳞状细胞癌、肺腺癌、肺鳞癌、前列腺腺癌、直肠腺癌、胃癌、子宫内膜癌中的表达下调,在胆管癌中呈高表达,差异均有统计学意义(P<0.05)。见图1ⓐ。进一步通过GSCA、UALCAN和HCCDB数据库资料进行验证,结果证实eIF4E3在HCC中呈低表达,与正常肝组织比较差异有统计学意义(P<0.05)。见图1ⓑ～ⓓ。

ⓐ针对TIMER数据库数据分析eIF4E3在不同肿瘤组织和正常组织中的表达差异情况;ⓑGSCA分析显示eIF4E3在肿瘤组织中低表达(P<0.001);ⓒ应用UALCAN数据库资料分析eIF4E3在HCC组织和正常肝组织中的表达差异(P=0.002);ⓓ应用HCCDB数据库资料分析eIF4E3在HCC组织和正常肝组织中的表达差异(红色代表肿瘤组织,灰色代表正常组织)。*P<0.05

2.2eIF4E3表达水平与患者性别、肿瘤分期的关联性分析结果 基于UALCAN数据库资料分析结果显示,正常肝组织eIF4E3表达水平显著高于Stage 1和Stage 2期的HCC组织(P<0.05),且肿瘤分期为Stage 3的HCC组织eIF4E3表达水平显著高于Stage 1(P=0.047)。见图2ⓐ。女性HCC患者eIF4E3表达水平显著高于男性(P=0.002)。见图2ⓑ。

图2 eIF4E3表达水平与患者性别、HCC病理分期的关联性分析结果图(*P<0.05)

2.3eIF4E3表达水平与HCC患者生存预后的关联性分析结果 基于GSCA数据库资料的分析结果显示,以eIF4E3表达量的中位数为界值将HCC患者分为eIF4E3低表达组(185例)和eIF4E3高表达组(185例),eIF4E3低表达组的总生存期(overall survival,OS)、无病生存期(disease-free survival,DFS)、无病进展生存期(progression-free survival,PFS)和无疾病间隔(disease-free interval,DFI)均较eIF4E3高表达组显著缩短(P<0.05)。见图3ⓐ～ⓓ。进一步通过Kaplan-Meier Plotter验证eIF4E3表达与患者生存预后的关联性,结果显示eIF4E3低表达HCC患者的OS较eIF4E3高表达者更差,差异有统计学意义(P<0.05)。见图3ⓔ。

ⓐ两组OS比较的生存曲线图,P=0.029;ⓑ两组PFS比较的生存曲线图,P=0.024;ⓒ两组DFS比较的生存曲线图,P=0.018;ⓓ两组DFI比较的生存曲线图,P=0.032;ⓔ基于Kaplan-Meier Plotter数据库资料的两组OS比较的生存曲线图,P=0.014

2.4eIF4E3功能富集分析结果 应用Linked Omics数据库鉴定eIF4E3的共表达基因(见图4ⓐ),排位前50的eIF4E3正、负相关基因的热图见图4ⓑⓒ。按其相关程度排前3位的正相关基因分别是C14orf37、STK17B和TLR2(r=0.601,P<0.001;r=0.596,P<0.001;r=0.575,P<0.001)。GO分析结果显示,eIF4E3互作基因的生物过程(biological process,BP)主要集中在细胞黏附正向调节、T细胞活化过程、白细胞活化调节、细胞外结构组织、线粒体基因表达、线粒体呼吸链复合物组装和细胞质翻译等。见图4ⓓ。KEGG分析结果显示,eIF4E3的共表达基因富集在血小板活化、破骨细胞分化和细胞黏附等途径。见图4ⓔ。另外,通过Sanger Box网站筛选出529个共表达基因,并对其进行GO分析和KEGG分析,结果显示eIF4E3的表达可能通过调节TME的免疫反应在HCC发生、发展中发挥作用。见图5。

2.5eIF4E3与TME中免疫浸润的关联性分析结果

TISIDB分析结果显示,eIF4E3在HCC的不同免疫亚型中的表达差异有统计学意义(P<0.05)。见图6ⓐ。eIF4E3在创面愈合亚型(C1型)和淋巴细胞耗尽亚型(C4型)中低表达,在干扰素γ优势亚型(C2型)和炎性亚型(C3型)中高表达。eIF4E3表达水平与自然杀伤(natural killer,NK)细胞(r=0.456,P<0.001)、Th1细胞(r=0.417,P<0.001)和CD8+效应记忆T细胞(r=0.414,P<0.001)的浸润丰度呈正相关。见图6ⓑ～ⓓ。Sanger Box数据库的CIBERSORT模块分析结果显示,在22种免疫细胞中,eIF4E3表达水平与初始CD4 T细胞、静息NK细胞、单核细胞、静息肥大细胞及嗜酸性粒细胞的浸润丰度呈显著负相关(P<0.05),与静息CD4记忆T细胞、活化CD4记忆T细胞、M1巨噬细胞、活化树突状细胞、静息树突状细胞及中性粒细胞浸润丰度呈正相关(P<0.05)。见图7ⓐ。Estimate模块分析结果显示,HCC中eIF4E3的表达水平与间质评分、免疫评分以及估计评分呈正相关(P<0.05)。见图7ⓑ～ⓓ。Sanger Box生物信息分析平台IPS模块的分析结果显示,eIF4E3表达水平与IPS呈正相关(P<0.05),提示eIF4E3表达量越低,患者的免疫治疗反应越差。见图7ⓔ。

图4 基于Linked Omics数据库资料进行的eIF4E3功能富集分析结果图

ⓐGO分析结果;ⓑKEGG分析结果

ⓐeIF4E3在HCC的不同免疫亚型中的表达水平比较结果;ⓑ～ⓓeIF4E3表达水平与NK细胞、Th1细胞和CD8+效应记忆T细胞浸润丰度的相关性分析结果

ⓐ应用CIBERSORT算法得到eIF4E3表达水平与22种免疫细胞浸润丰度的关系(*P<0.05)。ⓑ～ⓓ应用Estimate算法得到eIF4E3表达水平与HCC的间质评分、免疫评分和估计评分的相关性;ⓔLIHC中eIF4E3表达水平与IPS相关性

3 讨论

3.1N7-甲基鸟苷(N7-methyladenosine,m7G)修饰与各种癌症的发生、进展及治疗效果的关系已成为目前研究的热点。eIF4E1在细胞质中以m7G帽结构为基础发挥作用,运输一系列与细胞增殖、存活和转移相关的mRNA,这可能是其致癌的主要机制[9]。eIF4E3是m7G相关基因,是eIF4E蛋白的第3亚家族[20],作为mRNA代谢调节因子,它可与m7G帽结构特异性结合,并在细胞内竞争性抑制eIF4E1,是依赖于m7G非典型帽结合活性的肿瘤抑制因子[9]。研究发现,eIF4E3在结肠癌组织、急性髓系白血病标本以及头颈部鳞状细胞癌组织中表达下调[7,21]。也有研究表明,eIF4E3过表达与乳腺癌细胞存活率提高有关[22],miR-501可通过靶向下调eIF4E3表达而促进胃癌细胞增殖、迁移和侵袭[23]。

3.2HCC严重威胁人类生命健康,其危险因素主要有肝炎病毒感染、饮酒、肥胖和黄曲霉毒素等[24]。虽然近年来HCC的治疗已取得显著进展,但HCC的早期症状并不典型,缺乏特异度较高的生物标志物辅助临床诊断,大多数患者在确诊时已至晚期,5年生存率仅为18.4%左右[6,25]。本文通过公共数据库探讨eIF4E3作为诊断HCC及预测患者预后生物标志物的应用潜力。结果表明,eIF4E3在HCC组织中呈低表达,这与Osborne等[8]的研究结果一致,且肿瘤分期为Stage 3的HCC组织eIF4E3表达水平显著高于Stage 1;女性HCC患者eIF4E3表达水平显著高于男性。进一步的生存分析结果提示,eIF4E3低表达与患者较差的预后有关,这与Wang等[22]的研究结论相符。GO分析和KEGG分析结果表明,eIF4E3的生物学功能主要与细胞黏附和免疫反应有关,且主要富集于PI3K/Akt信号通路以及癌症途径,提示eIF4E3对HCC的作用机制可能与免疫调节有关。

3.3肿瘤浸润性免疫细胞(tumor infiltrating immune cells,TIICs)可以调节肿瘤的发生、发展[26],TME中的免疫细胞丰度以及肿瘤纯度会影响HCC患者的预后及免疫治疗效果[27]。本研究通过多个工具网站进行交叉验证表明,eIF4E3表达水平影响免疫细胞浸润丰度,与NK细胞、Th1细胞和CD8+效应记忆T细胞的浸润丰度呈正相关。NK细胞和T细胞是典型的免疫促进细胞,是HCC中主要负责杀伤癌细胞的淋巴细胞亚群[28]。Th1细胞具有抗原提呈的作用,使诱导产生的CD8+T细胞具备更强的效应功能,发挥免疫应答作用[29]。本结果提示,在eIF4E3高表达的HCC中,免疫微环境具有较高的免疫原性,有利于抗肿瘤免疫功能执行,遏制肿瘤的进展。免疫检查点(immune check point,ICP)基因对免疫细胞功能及免疫治疗效果有很大的影响[30],ICP抑制剂作为新兴的肿瘤治疗方法在癌症治疗方面取得了重大突破[31]。研究表明,HCC的程序性细胞死亡1(programmed cell death 1,PD-1)、程序性死亡受体-1配体(programmed death receptor-1 ligand,PD-L1)等ICP基因表达水平上升会导致免疫抑制,促进肝癌的进展[32]。笔者认为eIF4E3在HCC中具有强大的免疫调节能力,可影响ICP基因的表达水平,有作为免疫治疗标志物的应用前景,未来可联合临床试验和基础实验对eIF4E3在HCC微环境中的免疫调节作用及分子机制进行更深入的探索。

综上所述,eIF4E3在HCC中呈低表达,且与疾病的恶性进展具有关联性,可为HCC患者的免疫治疗及分层管理提供参考,其机制可能与免疫细胞浸润丰度调控有关,但仍需通过临床和基础研究进一步验证。