骨关节炎患者滑膜组织sestrin2 mRNA、mTORC1 mRNA表达水平及其与预后的关联性分析

付道通, 刘长杰, 张益民

骨关节炎是临床最常见的退行性疾病,也是老年人残疾的主要原因,为患者及其家庭带来巨大的健康和经济负担[1-2]。目前,临床尚无标准的关节炎治疗方法,其治疗目的主要是延缓疾病进展、缓解疼痛,部分患者最终可能会发展为终末期[3]。因此,目前亟需寻找骨关节炎预后相关生物标志物,以促进高危患者的早期筛查和干预,改善患者预后。既往研究显示,sestrin2过表达可增加磷酸腺苷(adenosine monophosphate,AMP)激活蛋白激酶信号的活性,恢复线粒体生物发生并抑制神经炎症,进而减轻骨关节炎疼痛[4]。哺乳动物雷帕霉素复合物1(mammalian target of rapamycin complex 1,mTORC1)可协调骨关节炎颞下颌关节软骨细胞的自噬和凋亡信号,与骨关节炎的发生、发展密切相关[5]。鉴此,本研究旨在分析骨关节炎患者滑膜组织sestrin2 mRNA、mTORC1 mRNA的表达水平及其与患者预后的关联性,以期为临床治疗方案的制定提供理论依据。

1 对象与方法

1.1研究对象 招募2019年10月至2022年10月潍坊市人民医院收治的骨关节炎患者120例,均接受膝关节置换术,根据患者术后6个月的Lysholm评分情况将其分为预后不良组(<70分,31例)和预后良好组(≥70分,89例)[6]。两组基线资料比较差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。见表1。本研究获医院医学伦理委员会批准(19Z0235),患者知情同意参与。

表1 两组基线资料比较

1.2纳入与排除标准 纳入标准:(1)经CT或彩色多普勒超声检查,符合《骨关节炎诊疗指南(2018年版)》[7]中关于骨关节炎的诊断标准;(2)单侧病变;(3)患者临床资料及随访资料完整。排除标准:(1)合并骨结核、骨肿瘤或其他骨代谢异常疾病者;(2)合并其他急慢性炎症性疾病、免疫系统疾病、感染性疾病者;(3)有类风湿性关节炎者;(4)认知障碍或精神异常疾病者。

1.3治疗方法 参考《骨关节炎诊疗指南(2018年版)》[7]对研究对象进行膝关节置换术治疗。患者取平卧位,行持续硬膜外联合蛛网膜下腔阻滞麻醉。患肢安装止血带,于膝前正中取切口,采集滑膜组织(0.2 cm×0.2 cm),切除后方所有骨赘,于股骨远端截骨,髓内定位。于股骨远端切入开口,长杆置入深度需达股骨峡部,短杆置入深度约为20 cm。行胫骨平台截骨,骨水泥固定。

1.4滑膜组织sestrin2 mRNA、mTORC1 mRNA水平检测 采用超声波粉碎滑膜组织后于无菌环境中加入磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffered saline,PBS)进行研磨,制成匀浆后以3 000 r/min离心15 min,取上清液转移至干燥洁净EP管中,-80 ℃保存备检。应用RNA提取试剂盒(上海瓦兰生物科技有限公司)提取滑膜组织的总RNA,后采用反转录试剂盒(上海联硕生物科技有限公司)将其反转录得cDNA,并以cDNA为模板进行实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)。qRT-PCR反应参数:95 ℃预变性5 min;95 ℃变性30 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共40个循环。所用引物序列见表2。以GAPDH为内参,通过2-△△CT法计算sestrin2 mRNA、mTORC1 mRNA的相对表达量。

表2 引物序列

1.5关节液炎性标志物检测 于患者入院后24 h内无菌抽取关节液1 ml,3 000 r/min离心10 min后取上清液。采用酶联免疫吸附(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)法检测关节液白细胞介素-8(interleukin-8,IL-8)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的表达水平,检测试剂盒购自武汉华尔纳生物科技有限公司,实验操作严格按照试剂盒说明书进行。

2 结果

2.1两组滑膜组织sestrin2 mRNA、mTORC1 mRNA及关节液炎性标志物表达水平比较 预后不良组mTORC1 mRNA、IL-8、IL-6、TNF-α水平显著高于预后良好组(P<0.05),sestrin2 mRNA水平显著低于预后良好组(P<0.05)。见表3。

表3 两组滑膜组织sestrin2 mRNA、mTORC1 mRNA及关节液炎性标志物表达水平比较

2.2骨关节炎预后不良患者滑膜组织sestrin2 mRNA、mTORC1 mRNA与关节液炎性标志物的相关性分析结果 Pearson相关分析结果显示,骨关节炎预后不良患者滑膜组织sestrin2 mRNA水平与关节液IL-8、IL-6、TNF-α水平均呈负相关(P<0.05),mTORC1 mRNA水平与IL-8、IL-6、TNF-α水平均呈正相关(P<0.05)。见表4。

表4 骨关节炎预后不良患者滑膜组织sestrin2 mRNA、mTORC1 mRNA与关节液炎性标志物的Pearson相关分析结果

2.3影响骨关节炎患者预后不良的多因素logistic回归分析结果 以骨关节炎患者预后情况为因变量(预后不良=1,预后良好=0),以滑膜组织sestrin2 mRNA、mTORC1 mRNA,以及关节液IL-8、IL-6、TNF-α为自变量进行多因素logistic回归分析。结果显示,滑膜组织mTORC1 mRNA表达水平上升是促进骨关节炎患者预后不良发生的独立危险因素(P<0.05),而较高水平的sestrin2 mRNA是抑制骨关节炎患者预后不良发生的保护因素(P<0.05)。见表5。

表5 影响骨关节炎患者预后不良的多因素logistic回归分析结果

2.4滑膜组织sestrin2 mRNA、mTORC1 mRNA水平对骨关节炎患者预后的预测价值 ROC曲线分析结果显示,滑膜组织sestrin2 mRNA、mTORC1 mRNA水平能有效预测患者的预后情况(P<0.05),且两者联合的预测效能更优[AUC(95%CI)=0.906(0.848～0.963),P<0.001],灵敏度和特异度分别为93.53%、78.76%。见表6,图1。

表6 滑膜组织sestrin2 mRNA、mTORC1 mRNA水平预测骨关节炎患者预后的ROC曲线分析结果

图1 滑膜组织sestrin2 mRNA、mTORC1 mRNA水平预测骨关节炎患者预后的ROC曲线图

3 讨论

3.1骨关节炎作为一种非炎性滑膜关节退行性疾病,影响全球60岁以上10%的男性和16%的女性,其主要特征是软骨破坏、软骨下骨损伤、滑膜炎症和骨赘形成[8]。骨关节炎的发生与年龄、劳损、创伤等多种因素有关,但确切病因及发病机制尚不清楚[9]。骨关节炎可涉及身体各部位关节,包括身体承重关节膝关节、髋关节和脊柱,严重影响关节的正常功能和患者生活质量,严重时甚至会导致残疾[10]。由于目前缺乏骨关节炎早期诊断及预后预测的有效方法,使得许多患者确诊时疾病已发展至终末期,需行关节置换手术,给患者带来较大的负担[11-12]。

3.2sestrin2是一种高度保守的蛋白分子,位于编码基因6号染色体,属于sestrin家族。其不仅参与调控心血管疾病,而且在癌症、椎间盘退变、神经退行性疾病的发生、发展中也发挥了重要作用[13]。sestrin2是一种应激反应蛋白,可调控AMP激活蛋白激酶-mTORC1通路,对抗氧化应激和抗细胞毒性有细胞保护作用[14]。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)是一种高度保守的蛋白激酶,其中mTORC1是雷帕霉素的敏感靶点,与细胞自噬密切相关[15-16]。本研究结果显示,滑膜组织中sestrin2 mRNA呈低表达,mTORC1 mRNA呈高表达,推测sestrin2、mTORC1参与骨关节炎疾病进展的可能机制为:(1)低表达sestrin2对mTORC1的抑制作用降低,骨关节炎患者体内抗氧化应激和抗炎症作用降低,炎症及其诱导的分解代谢作用使软骨功能改变,导致疾病进展。既往研究表明,炎症及其诱导的分解代谢作用可导致软骨细胞数量减少、软骨功能改变、软骨细胞外基质进一步分解,进而在骨关节炎的疾病进展中发挥重要作用[17-18]。(2)sestrin2表达降低,使得其抑制细胞凋亡和软骨细胞外基质降解的功能减弱。Tu等[19]研究发现,sestrin2可通过抑制mTORC1和激活AMP激活蛋白激酶信号活性增强自噬,进而抑制应激诱导的细胞凋亡和细胞外基质降解。另外,本研究结果显示,滑膜组织sestrin2 mRNA、mTORC1 mRNA水平与关节液炎性标志物均具有显著相关性。分析认为这一现象可能是由于骨关节炎患者机体强烈的炎症级联反应通过细胞因子网络系统,启动了滑膜组织的成骨功能。既往文献报道显示,炎性因子IL-8、IL-6、TNF-α水平均与骨关节炎患者关节功能及临床症状严重程度相关[20],进一步佐证了sestrin2、mTORC1与骨关节炎发生、发展的关联性。提示在临床治疗骨关节炎时,临床医师不仅需要重视控制炎症反应,亦应关注软骨细胞数量以及软骨功能的改变情况。

3.3本研究结果显示,滑膜组织sestrin2 mRNA、mTORC1 mRNA水平均可有效预测骨关节炎患者的预后情况,且二者联合的预测效能更高,灵敏度和特异度分别达93.53%、78.76%。据此,对于滑膜组织sestrin2 mRNA相对表达量低于0.86、mTORC1 mRNA高于1.27的骨关节炎患者,临床医师应予以重视,积极调整治疗方案以改善患者预后。

综上所述,滑膜组织sestrin2 mRNA表达水平降低、mTORC1 mRNA表达水平升高与骨关节炎患者预后不良相关,这为临床早期诊治提供了新思路。但对于sestrin2和mTORC1诱发骨关节炎的具体机制尚需进一步研究验证。