不同硒累积型水稻耐高硒毒害差异特征研究

卜少腾 李衍亮 李玉义 谭卓贤 张 木

（1东莞理工学院生态环境与建筑工程学院，广东 东莞 523808；2广东省农业科学院农业资源与环境研究所/农业农村部南方植物营养与肥料重点实验室/广东省养分资源循环利用与耕地保育重点实验室，广东 广州 510640；3中国农业科学院农业资源与农业区划研究所，北京 100081；4仲恺农业工程学院资源与环境学院，广东 广州 510225）

硒（selenium，Se）是人和动物所必需的微量营养元素，在维持健康的免疫系统和降低疾病风险方面起到关键作用［1］。我国大面积土壤缺硒，加之部分富硒地区因土壤偏酸而导致硒有效性较低，植物吸收困难，作物产品中的硒含量普遍偏低，人们通常采用外源施硒的手段来提升作物产品中的硒含量［2-4］。硒并非植物所必需的营养元素，有益和有害的界限较窄，低浓度硒可提高叶绿素含量、增强植物抗逆性，进而促进植物生长，高浓度硒则会对植物造成严重毒害作用［5-6］。不同种类的植物富硒能力不同，同种作物不同品种之间的富硒能力有时也存在较大差异，对硒的敏感性也不同［7］。不同种类植物体中硒对抗氧化系统的作用阈值存在差异，适量硒可能起到正向调节作用，过量硒则会诱导氧化应激产生过量活性氧并造成细胞膜损伤［8-9］。植物可以通过自身防御系统调节酶类抗氧化剂超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、过氧化物酶（peroxidase，POD）、过氧化氢酶（catalase，CAT）及非酶类抗氧化剂抗坏血酸（ascorbic acid，ASA）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）和类胡萝卜素（carotene，CAR）等活性氧的过度积累，以保护植物细胞组织免受自由基的毒害。逆境条件下，碳氮代谢产物含量的增加能够为植物生长提供能量以及建构物质，是植物抵御逆境胁迫的物质基础［10］，且对植物抵抗硒毒害具有重要作用。除此之外，硒超累积植物还能将更多的硒结合在非关键代谢组织，避免过量的硒直接参与核心代谢过程，从而具有较强的耐高硒毒害能力［11］。水稻并非硒超累积植物，不同水稻品种对硒的富集能力差别较大，硒高累积水稻品种耐高硒毒害的能力要强于硒低累积水稻品种，但其具体生长、生理作用差异机制仍不明确。因此，本研究以硒高、低累积水稻品种为研究对象，通过盆栽试验研究硒高累积水稻和硒低累积水稻在不同硒水平下的生长特征差异，旨在为生产富硒水稻提供技术和理论参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试水稻（OryzasativaL.）品种为华南双季稻区广泛种植的常规水稻品种美香占和晚丝香，均由广东省农业科学院水稻研究所提供（为广东省农业科学院农业资源与环境研究所土壤与肥料项目团队在华南双季稻区长期开展水稻增效富硒技术试验研究中筛选所得）。其中美香占为相对硒高累积水稻品种（H-Se），晚丝香为相对硒低累积水稻品种（L-Se）。试验试剂为亚硒酸钠（Na2SeO3），由农业农村部南方植物营养与肥料重点实验室提供。供试土壤为广东省佛山市高明区更合镇的粘壤土，基本理化性质如下：pH值4.70、有机质含量27.10 g·kg-1、碱解氮172.90 mg·kg-1、有效磷25.60 mg·kg-1、速效钾141.00 mg·kg-1、总硒0.21 mg·kg-1。

1.2 试验方法

试验于2021年7月在广东省农业科学院农业资源与环境研究所盆栽场的温室大棚中开展，盆栽装置为聚氯乙烯（polyvinyl chloride，PVC）材质桶，每桶装土3 kg，土壤装桶前先过2 cm 网筛。试验设置0、0.5、25 mg·kg-1共3 个硒处理，以Na2SeO3为硒源。大量元素肥料用量为每千克土壤施N 0.2 g、P2O50.15 g、K2O 0.2 g，分别以尿素［CO（NH2）2］、磷酸二胺［（NH4）2HPO4］、氯化钾（KCl）作为肥源。其中钾、磷肥全部作基肥施入，氮肥基施60%，拔节期追施40%。为保证植株营养需求，每千克土壤再补施1 mL 浓缩1 000 倍的阿农微量元素营养液。所有肥料均配成溶液施入土壤。水稻生长期从7月20日持续到11月25日，水稻采用移栽的方式，每桶定苗1 株，每个处理重复8 次。水稻生长期间定期定量进行水分浇灌，严格进行病虫害防治，各环节均按照盆栽模拟试验技术规范进行，最大程度上保证数据的准确性和可靠性。

1.3 测定项目与方法

土壤基本理化性质测定参照《土壤农化分析》［12］中的常规分析方法。其中碱解氮含量采用碱解扩散法测定；有效磷含量采用钼蓝比色法测定；速效钾含量采用火焰光度法测定；有机质含量采用重铬酸钾容量法-外加热法测定。土壤pH 值采用PHS-3E 型实验室pH 计（上海仪电科学仪器股份有限公司）测定。土壤总硒含量的测定参照《NY/T 1104-2006 土壤中全硒的测定》［13］，消解后采用AFS-9230 原子荧光光度计（北京吉天仪器有限公司）测定。

于拔节期采集各处理4 个重复水稻叶片，测定丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量、抗氧化酶活性、抗氧化物质和碳氮代谢产物含量，以及硒结合蛋白基因（selenium-binding protein 1，SBP1）的相对表达量。其中，超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）活性分别采用氮蓝四唑（nitro-blue tetrazolium，NBT）光还原法、紫外吸收法、愈创木酚法测定［14］；类胡萝卜素含量采用乙醇提取比色法测定，抗坏血酸含量采用2，6-二氯靛酚滴定法测定，丙二醛含量采用硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）显色法测定，还原性谷胱甘肽（GSH）采用二硫代双二硝基苯甲酸（5，5′-dithio-bis-nitrobenzoic acid，DTNB）比色定量法测定，可溶性糖、可溶性蛋白、游离脯氨酸等碳氮代谢产物含量分别采用蒽酮比色法、考马斯亮蓝法、酸性茚三酮法测定［15-16］。SBP1基因采用实时荧光定量PCR 进行测定（正向引物：5′-GTATCAACCTCGTCACA AG-3′；反向引物：3′-CTTCCATAGAGACCATCCT-5′）。

于成熟期将各处理剩余4 个重复的水稻穗取下，在室内风干、考种测定水稻的实际产量。之后将各处理的水稻植株按根、茎叶和谷粒分开清洗干净并吸干水分，将水稻植株样品置于烘箱中105 ℃杀青30 min，最后在75 ℃下烘干至恒重，用于后续试验分析。分别称量水稻茎叶和根系干重，并记为地上部和根系干物质量。按公式（1）和（2）计算地上部和根系硒累积量。水稻组织硒含量测定采用微波消解-原子荧光氢化物发生法，将烘干至恒重的水稻样品粉碎过筛，称取0.2 g于消解罐中，依次加入4 mL 浓硝酸、1 mL 双氧水和1 mL 去离子水进行微波消解，消解结束后再加入5 mL 1∶1的盐酸，随后于电热板上加热赶酸至澄清，在剩余溶液为2～3 mL 时停止加热，冷却至室温，转移至25 mL 容量瓶定容，采用原子荧光测定溶液中的硒含量［17］。水稻植株硒含量的分析检测过程采用空白对照、样品4次重复、标准曲线校正等进行数据质量控制。

1.4 数据处理

使用Sigma Plot 12.5 软件绘图，采用SPSS 12.0 软件进行数据处理和方差分析，文中数据为平均值±标准误。各处理平均值的多重比较采用最小显著性差异法（least significant difference，LSD）（P<0.05）。

2 结果与分析

2.1 施硒对两个水稻品种产量、地上部和根系干物质量的影响

由图1 可知，不施硒时，两个水稻品种的单株产量、地上部和根系干物质量均无显著差异。施用低浓度硒（0.5 mg·kg-1）时，硒低累积水稻的单株产量和地上部干物质量较不施硒无显著差异，但显著提升了硒高累积水稻的产量和地上部干物质量。与不施硒相比，施用高浓度硒（25 mg·kg-1）显著降低了两个水稻品种的单株产量、地上部和根系干物质量，但硒低累积水稻的降幅更大，其中硒高累积水稻的单株产量和地上部干物质量显著高于硒低累积水稻，而两者间根系干物质量则无显著差异。

图1 施硒对两个水稻品种产量、地上部和根系干物质量的影响Fig.1 Effects of selenium application on yield，shoot and root dry matter quality of two rice varieties

2.2 施硒对两个水稻品种硒含量及累积量的影响

由图2 可知，随着施硒水平的提高，两个水稻品种的谷粒、茎叶和根中硒含量均显著增加。不施硒时，两个水稻品种各部位硒含量无显著差异。在0.5 mg·kg-1的施硒水平下，两个水稻品种硒含量仅在谷粒中存在显著性差异，且硒高累积水稻的谷粒硒含量显著高于硒低累积水稻。当施硒水平为25 mg·kg-1时，硒高累积水稻的谷粒、茎叶和根中硒含量均显著高于硒低累积水稻。

图2 施硒对两个水稻品种各组织硒含量的影响Fig.2 Effects of Selenium application on Selenium content in tissues of two rice varieties

由图3可知，在0.5 mg·kg-1施硒水平下，两个水稻品种的地上部和根系硒累积量与不施硒相比均显著增加，增幅分别为226.10%、311.10% 和331.56%、348.47%，并且硒高累积水稻的地上部硒累积量显著高于硒低累积水稻。两个水稻品种的地上部和根系硒累积量均在25 mg·kg-1施硒水平下达到最大值，其中硒高累积水稻的地上部和根系硒累积量分别是硒低累积水稻的1.60和1.20倍。

图3 施硒对两个水稻品种地上部和根系硒累积量的影响Fig.3 Effects of selenium application on selenium accumulation in shoots and roots of two rice varieties

2.3 施硒对两个水稻品种MDA含量的影响

由图4 可知，随着施硒水平的提高，硒低累积水稻的MDA含量显著升高，而硒高累积水稻的MDA含量仅在25 mg·kg-1施硒水平下显著升高。不施硒条件下两个水稻品种的MDA 含量无显著差异。0.5 和25 mg·kg-1施硒水平下，硒低累积水稻的MDA 含量均显著高于硒高累积水稻。与不施硒相比，高施硒水平（25 mg·kg-1）下硒低累积水稻和硒高累积水稻的MDA 含量增幅分别为175.20 %和118.50 %。

图4 施硒对两个水稻品种MDA含量的影响Fig.4 Effects of Selenium application on MDA content in two rice varieties

2.4 施硒对两个水稻品种抗氧化酶活性的影响

由图5 可知，随着施硒水平的提高，两个水稻品种的SOD、POD 和CAT 活性均呈现出先升高而后降低的变化趋势。不施硒条件下两个水稻品种的SOD、POD和CAT 活性均无显著差异。而0.5 和25 mg·kg-1施硒水平下两水稻品种间的SOD、POD 和CAT 活性均存在显著差异，且硒高累积水稻的SOD、POD 和CAT 活性显著高于硒低累积水稻。

图5 施硒对两个水稻品种SOD、POD和CAT活性的影响Fig.5 Effects of selenium application on SOD，POD and CAT activities in two rice varieties

2.5 施硒对两个水稻品种非酶类抗氧化物质含量的影响

由图6 可知，随着施硒水平的提高，两个水稻品种的ASA 和CAR 含量均呈现出先升高再降低的变化趋势，而GSH 含量则持续增加。不施硒条件下两水稻品种间的ASA、GSH 和CAR 含量均无显著差异。在0.5 mg·kg-1施硒水平下，硒高累积水稻的ASA、GSH和CAR 含量分别比硒低累积水稻显著提高了16.20%、14.30%和15.80%。高施硒水平（25 mg·kg-1）下，硒高累积水稻的ASA 含量显著高于硒低累积水稻，而CAR含量则无显著差异。

图6 施硒对两个水稻品种ASA、GSH和CAR含量的影响Fig.6 Effects of selenium application on ASA，GSH and CAR contents in two rice cultivars

2.6 施硒对两个水稻品种碳氮代谢物质含量的影响

由图7 可知，随着施硒水平的提高，两个水稻品种的可溶性糖和可溶性蛋白含量均呈现出先升高后降低的变化趋势，而脯氨酸含量则持续增加。不施硒条件下两个水稻品种的可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸含量均无显著差异。当施硒水平为0.5 和25 mg·kg-1时，与硒低累积水稻相比，硒高累积水稻的可溶性糖含量均显著增加了0.01 个百分点，可溶性蛋白含量则分别显著增加了13.20%和24.60%。两个水稻品种间的脯氨酸含量仅在高施硒水平下达到显著差异，以高施硒水平下硒高累积水稻的脯氨酸含量为最高。

图7 施硒对两个水稻品种可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸含量的影响Fig.7 Effects of selenium application on the contents of soluble sugar，soluble protein and proline in two rice varieties

2.7 施硒对两个水稻品种硒结合蛋白基因相对表达量的影响

由图8 可知，不施硒条件下，硒低累积水稻的硒结合蛋白基因SBP1相对表达量显著高于硒高累积水稻，施硒整体显著提高了硒高累积水稻的SBP1相对表达量，但降低了硒低累积水稻的SBP1相对表达量。在0.5 和25 mg·kg-1施硒水平下，硒高累积水稻的SBP1相对表达量均高于硒低累积水稻，并且在高硒水平下达到显著差异。

图8 施硒对两个水稻品种SBP1相对基因表达量的影响Fig.8 Effects of selenium application on relative expression of SBP1 gene in two rice varieties

3 讨论

施用适量硒可增强植物的抗氧化能力，进而提升冬小麦［18］、甜玉米［19］、谷子［20］等多种作物的产量。当硒浓度过高时，硒可作为促氧化剂介导发生氧化应激反应，导致植物代谢紊乱和生物量降低［21］。本研究发现，施用低浓度硒（0.5 mg·kg-1）对硒高累积水稻的单株产量和地上部干物质量均有显著提升作用，但对硒低累积水稻的提升不明显。施用高浓度硒（25 mg·kg-1）显著降低了两个水稻品种的单株产量和地上部干物质量，且对硒低累积水稻的降幅更大。值得注意的是，在高浓度硒水平下，硒高累积水稻的各部位硒含量及单株产量和地上部干物质量均显著高于硒低累积水稻，这充分表明硒高累积水稻具有更强的硒适应性。不同种类植物对硒的吸收、积累能力不同，同种作物不同品种对硒的吸收、积累能力有时也存在较大差异［7］。本研究中，在25 mg·kg-1施硒水平下，硒高累积水稻的地上部、根系硒含量和硒累积量均显著高于硒低累积水稻，说明硒高累积水稻对硒的吸收积累能力显著高于硒低累积水稻。此外，根系的生长和形态分布是体现其吸收功能和吸收效率的重要指标之一，硒高累积水稻的根系干物质量要高于硒低累积水稻，这也可能是硒高累积水稻吸收、积累硒较多的原因之一。

在遭受胁迫时，植物组织内的活性氧（ROS）不断累积，当ROS 累积量超过一定阈值时会对细胞结构产生不利影响［22］。丙二醛（MDA）作为判断植物氧化应激和监测ROS 的良好生物标志物［23］，可通过测定其含量变化来推测植物受损的严重程度。有研究表明，水稻幼苗在不同硒浓度水溶液中培养5 d 后，其叶片MDA含量随硒浓度的增加而显著增加［24］。本研究结果与之相符，即两个水稻品种的MDA 含量随施硒水平的增加而增加。在两个硒水平上，硒低累积水稻的MDA含量均显著高于硒高累积水稻，表明硒高累积水稻在不同硒浓度下的氧化应激调控能力均强于硒低累积水稻。

抗氧化酶系统在缓解植物氧化胁迫方面也发挥着重要功能，SOD、CAT 和POD 等抗氧化酶能够清除ROS，保护细胞免受氧化应激引起的损伤［25］。本研究中，施用低浓度硒能显著提升硒高累积水稻的SOD、CAT 和POD 活性，但对硒低累积水稻影响不大。在高硒水平下，虽然两个水稻品种的抗氧化酶活性均有所降低，但硒高累积水稻的3 种抗氧化酶活性均显著高于硒低累积水稻，说明硒高累积水稻在高硒胁迫下具有更强的氧化胁迫缓解能力。ASA、GSH 和CAR 等非酶物质也在植物氧化应激防御中发挥重要作用［26-27］。低浓度硒提高了两个水稻品种的ASA 含量，而高浓度硒则降低了其含量，且在两个硒水平上硒高累积水稻的ASA 含量均显著高于硒低累积水稻。GSH 是重要的非酶类抗氧化剂，其主要作用是清除过氧化氢和修复细胞损伤。施硒显著提高了两个水稻品种的GSH含量，但高硒水平下硒低累积水稻的GSH 含量高于硒高累积水稻。相关研究表明，在亚硒酸盐及其代谢物存在的情况下，GSH 能促进ROS 的产生，过高浓度的硒也可能通过诱导GSH 含量增加及ASA 含量降低而导致ROS 过度产生，加剧硒低累积水稻的氧化应激和膜损伤［28-29］。CAR 可在光合作用中吸收并传递光电子，增强植物对光能的捕捉能力，同时也具备较强的抗氧化能力［30-31］。低硒水平下硒高累积水稻体内的CAR含量显著高于硒低累积水稻，但两个水稻品种在高硒水平下的CAR 含量无显著差异。总体而言，硒高累积水稻拥有更强的酶类及非酶类抗氧化系统，具有更强的氧化应激调控能力。

蛋白质和糖类可为植物的生长发育提供建构物质和能量，并在胁迫开始时增强植物的免疫力。有研究表明，镉胁迫下施用适量硒可提高芥菜体内可溶性糖和可溶性蛋白含量，为植物提供物质和能量供给，进而增强植物的抗胁迫能力［32］。本研究中，施硒处理下硒高累积水稻的可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸含量均高于硒低累积水稻，这可能是由于硒高累积水稻能够积极地调控水稻碳氮代谢水平，从而缓解高硒诱导的胁迫。此外，由于脯氨酸含量随施硒水平的增加而持续增加，因此推测脯氨酸含量可作为水稻植株在硒胁迫期间的重要观测指标。

硒结合蛋白基因（SBP1）编码的蛋白质对硒具有结合特性，该种结合方式类似于络合，可降低硒在植物体内的生物学活性［33］。SBP1基因的相对表达量增强，代表可以捕捉到更多活性硒，进而缓解过多的硒参与代谢过程所导致的毒害［33-35］。本研究中，施硒显著提高了硒高累积水稻的SBP1基因相对表达量，但降低了硒低累积水稻的SBP1相对表达量，表明硒高累积水稻组织内过量的硒会更多地与硒结合蛋白结合而降低其生物学活性，进而在一定程度上缓解高硒对水稻所造成的毒害。

4 结论

本研究结果表明，在遭受硒胁迫时，硒高累积水稻拥有更高的单株产量和地上部干物质量，说明硒高累积水稻对硒的耐受性较硒低累积水稻强。硒胁迫下，硒高累积水稻拥有更强的酶类和非酶类抗氧化系统、自由基清除能力及碳氮代谢能力，能提供更多的碳氮代谢产物以维持细胞的渗透压平衡。此外，硒高累积水稻硒结合蛋白基因（SBP1）的相对表达更强，能够避免更多的硒参与核心代谢过程而减轻其毒害作用。综上所述，硒高累积水稻较硒低累积水稻拥有更强的耐高硒毒害能力。