积雪草酸对葡聚糖硫酸钠诱导的溃疡性结肠炎小鼠肠黏膜屏障的保护作用及机制研究

李阳，徐秉忠，王加玉，闫梦丹，叶耘峰（.江苏护理职业学院，江苏 淮安 3003；.淮安市第一人民医院，江苏 淮安 300）

溃疡性结肠炎（UC）是一种常见的消化道慢性炎症性疾病。UC 的病变常由直肠开始，延伸至结肠末端，其特点为弥漫性黏膜炎症，且极易复发，治疗不当可造成肠道功能障碍，甚至引发结肠癌等严重后果[1]。近年来，UC 发病率在全球范围内呈上升趋势，临床用于症状控制的药物有糖皮质激素、5-氨基水杨酸类药物、免疫调节剂等，但治疗效果仍不能令人满意[1-2]。UC 的确切发病机制尚未阐明，但有证据[3]显示肠黏膜屏障的破坏对UC 的进展至关重要，肠黏膜可以防止肠腔中的有害物质渗出，其完整性破坏会增加结肠炎的易感性，进而加速炎症的发生，而黏膜屏障的完整性与连接蛋白的表达密切相关。

积雪草酸是传统中药积雪草Centellaasiatica（L.）Urb.中主要的天然五环三萜类成分之一，因其具有抗炎、抗肿瘤、抗氧化应激等多方面药理作用，以及对多种疾病具有治疗潜力而备受关注[4-5]。有研究[6]表明，积雪草酸可能通过抑制线粒体介导的NLRP3炎症小体的激活进而缓解UC 小鼠的症状，即通过缓解炎症反应发挥对UC 的治疗作用，但是否与肠黏膜屏障修复有关尚不清楚。因此，本研究拟基于肠上皮屏障修复角度探讨积雪草酸对UC 小鼠的治疗作用及机制，以期为UC 新药的研发提供参考。

1 材料与方法

1.1 动物 4 周龄雄性C57BL/6 小鼠30 只，SPF 级，14～18 g，由杭州医学院提供，实验动物生产许可证号：SCXK（浙）2019-0002，动物质量合格证号：20210407Abzz0100000502。本动物实验经淮安市第一人民医院伦理委员会批准，批文号：KY-2022-143-01。

1.2 药物及试剂 积雪草酸，南京春秋生物工程有限公司，批号：JXCS20210312；柳氮磺胺吡啶肠溶片（SASP），上海信谊天平药业有限公司，批号：02000052；4%多聚甲醛，合肥兰杰柯科技有限公司，批号：BL539A；葡聚糖硫酸钠（DSS），美国MP Biomedicals 生物医学公司，批号：216011080；肿瘤坏死因子α（TNF-α，批号：SEKR-0009）、白细胞介素6（IL-6，批号：SEKR-0005）、IL-1β（批号：SEKR-0002）试剂盒，均购自北京索莱宝科技公司；苏木素-伊红（HE）染色试剂盒，南京森贝伽生物公司，批号：BP-DL001；过碘酸-雪夫（PAS）染色试剂盒（批号：C0142M）、总RNA 抽提试剂（批号：R0011）、cDNA 逆转录试剂盒（批号：D7166）、PCR Master Mix（批号：D7228），均购自上海碧云天生物公司；BCA 蛋白定量试剂盒，美国Thermo 公司，批号：23246；黏蛋白2（MUC2）抗体（批号：A4767）、claudin-1 抗体（批号：A2196）、occludin 抗体（批号：A2601）、闭锁小带蛋白1（ZO-1）抗体（批号：A0659），均购自武汉爱博泰克生物公司；β-actin 抗体，北京博奥森生物技术有限公司，批号：bs-0061R。

1.3 主要仪器 Multiskan MK3 型酶标仪、iBright CL750 型凝胶成像系统、Applied Biosystems 实时定量PCR 仪，美国Thermo 公司；RM2235 型病理切片机，德国Leica 公司；BX53 型生物显微镜，日本Olympus 公司；1-14K 型高速低温离心机，德国Merck Sigma 公司。

1.4 分组、模型复制及给药 小鼠适应性饲养7 d后，随机分成5 组：空白组、模型组、柳氮磺胺吡啶组及积雪草酸低剂量组、积雪草酸高剂量组，每组6 只。将2.5% DSS 溶解在饮用水中供小鼠自由饮用10 d 以建立UC 模型[6]。造模同时灌胃给药，其中柳氮磺胺吡啶组给予450 mg·kg-1柳氮磺胺吡啶肠溶片；根据课题组前期预实验结果及相关研究[7]，积雪草酸低剂量组给予3 mg·kg-1积雪草酸，积雪草酸高剂量组给予30 mg·kg-1积雪草酸；空白组及模型组给予等量生理盐水，每天灌胃1 次，连续10 d。每日记录小鼠体质量、大便性状及便血情况，并参照相关研究[6-7]进行疾病活动指数（DAI）评分。小鼠出现体质量明显下降，DAI 显著升高，小鼠粪便松散或稀便，同时出现粪便隐血或肉眼血便，则表示模型建立成功。

1.5 标本采集及处理 末次给药后，小鼠禁食不禁水12 h，以3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，眼眶取血于抗凝EP 管中，室温下以4 000×g离心10 min，分离血浆，保存于-80 ℃冰箱待检。取血结束后，采用二氧化碳过量吸入处死小鼠，打开腹腔，分离结肠组织并测量长度。剪取结肠近端组织，固定于4%多聚甲醛溶液中，其余组织保存于-80 ℃冰箱。

1.6 结肠组织病理形态学观察 取固定后的小鼠结肠组织，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，制作切片并脱蜡；根据试剂盒说明书步骤进行HE、PAS 染色，在显微镜下观察结肠组织病理情况并拍照。

1.7 ELISA 法检测小鼠血浆中炎症细胞因子水平将“1.5”项下保存的血浆解冻后，严格按照ELISA试剂盒说明书步骤操作，检测炎症细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β 水平。

1.8 RT-qPCR 法检测小鼠结肠组织中MUC2、claudin-1、occludin、ZO-1 mRNA 表达 采用碧云天总RNA 试剂盒提取各组小鼠结肠组织总RNA并检测其纯度，逆转录获得cDNA；PCR 反应条件：预变性94 ℃、3 min，变性94 ℃、30 s，退火55 ℃、30 s，延伸72 ℃、1 min，共30 个循环。分析扩增曲线并计算Ct 值，以GAPDH 为内参，采用2-ΔΔCt法计算目的基因相对表达量，实验重复6 次。引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列见表1。

表1 RT-qPCR 引物序列Table 1 Primer sequences for RT-qPCR

1.9 Western Blot 法检测小鼠结肠组织中MUC2蛋白表达 取小鼠结肠组织称定质量，加入RIPA 裂解液（1% PMSF），冰上裂解30 min；以12 000×g离心10 min 后取上清，利用BCA 试剂盒定量蛋白浓度；每孔30 μg 蛋白量，加入5×SDS Loading buffer调整蛋白浓度；进行SDS-PAGE 电泳，将蛋白转印到PVDF 膜上，用5%脱脂奶粉溶液封闭1 h；加入MUC2 一抗（1∶1 000），4 ℃下孵育过夜；TBST 洗膜4 次后，加入IgG-HRP 二抗（1∶10 000），室温下孵育2 h；TBST 洗膜4 次后，进行ECL 显影并采集图像；使用ImageJ 软件分析蛋白条带灰度值，以β-actin 为内参，计算目的蛋白相对表达水平。

1.10 免疫组化法检测小鼠结肠组织中claudin-1、occludin、ZO-1 表达 取小鼠结肠组织切片，脱蜡、修复，滴加3%过氧化氢后孵育10 min；PBS洗涤3 次后，用5% BSA 封闭；滴加claudin-1、occludin、ZO-1 一抗（1∶200），过夜孵育后PBS 洗涤3 次，加入二抗孵育1 h；加入DAB 液及苏木素复染，脱水、封片，干燥后置于显微镜下观察并拍照；使用Image-Pro Plus 6.0 图像数据分析系统对结果进行积分光密度值（IOD/Area）分析。

1.11 统计学处理方法 采用SPSS 21.0 统计软件进行数据分析；计量资料以均数± 标准差（±s）表示；多组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），两两比较采用LSD 检验；以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 积雪草酸对UC 小鼠体质量及DAI 评分的影响结果见图1。与空白组比较，模型组小鼠的体质量显著下降（P＜0.01），DAI 评分显著升高（P＜0.01）。与模型组比较，柳氮磺胺吡啶组及积雪草酸低、高剂量组小鼠的体质量显著增长（P＜0.01），DAI 评分显著下降（P＜0.01）。结果表明，积雪草酸对DSS 诱导的UC 小鼠症状具有明显改善作用。

图1 积雪草酸对溃疡性结肠炎小鼠体质量和疾病活动指数（DAI）评分的影响（±s，n=6）Figure 1 Effects of asiatic acid on the body mass and disease activity index（DAI） score in ulcerative colitis mice（±s，n=6）

2.2 积雪草酸对UC 小鼠结肠组织病理变化的影响结果见图2。与空白组比较，模型组小鼠的结肠隐窝结构严重丧失，黏膜下层水肿明显，并伴有大量炎性浸润（如图2 黄色箭头所示），杯状细胞结构破坏严重，数量大量减少。与模型组比较，柳氮磺胺吡啶组和积雪草酸高剂量组小鼠的结肠隐窝结构恢复，黏膜水肿和炎性浸润减轻，杯状细胞结构和数量均有明显恢复；积雪草酸低剂量组小鼠的结肠隐窝结构、炎性浸润及杯状细胞结构和数量有一定程度改善。结果表明，积雪草酸对DSS 诱导的UC 小鼠结肠组织病理损伤具有明显改善作用。

图2 积雪草酸对溃疡性结肠炎小鼠结肠组织病理变化的影响（×200）Figure 2 Effect of asiatic acid on pathological changes of colonic tissue in ulcerative colitis mice（×200）

2.3 积雪草酸对小鼠血浆炎症细胞因子水平的影响结果见图3。与空白组比较，模型组小鼠的血浆TNF-α、IL-6、IL-1β 水平显著升高（P＜0.01）。与模型组比较，柳氮磺胺吡啶组和积雪草酸低、高剂量组小鼠的血浆TNF-α、IL-6、IL-1β 水平明显下降（P＜0.05，P＜0.01）。结果表明，积雪草酸可降低DSS 诱导的UC 小鼠炎症因子水平。

图3 积雪草酸对溃疡性结肠炎小鼠血浆炎症细胞因子水平的影响（±s，n=6）Figure 3 Effect of asiatic acid on plasma inflammatory cytokines in ulcerative colitis mice（±s，n=6）

2.4 积雪草酸对UC 小鼠结肠组织MUC2、claudin-1、occludin、ZO-1 mRNA 表达的影响 结果见图4。与空白组比较，模型组小鼠结肠组织MUC2、claudin-1、occludin、ZO-1 mRNA 表达显著下调（P＜0.01）。与模型组比较，积雪草酸低、高剂量组小鼠结肠组织MUC2、claudin-1、occludin、ZO-1 mRNA 表达明显上调（P＜0.05，P＜0.01）。

图4 积雪草酸对溃疡性结肠炎小鼠结肠组织MUC2、claudin-1、occludin、ZO-1 mRNA 表达水平的影响（±s，n=6）Figure 4 Effects of asiatic acid on the mRNA expression levels of MUC2，claudin-1，occludin and ZO-1 in colon tissue of ulcerative colitis mice（±s，n=6）

2.5 积雪草酸对UC 小鼠结肠组织MUC2 蛋白表达的影响 结果见图5。与空白组比较，模型组小鼠结肠组织MUC2 蛋白表达显著下调（P＜0.01）。与模型组比较，积雪草酸低、高剂量组小鼠结肠组织MUC2蛋白表达明显上调（P＜0.05，P＜0.01）。

图5 积雪草酸对溃疡性结肠炎小鼠结肠组织MUC2 蛋白表达水平的影响（±s，n=6）Figure 5 Effect of asiatic acid on MUC2 protein expression level of colon tissue in ulcerative colitis mice（±s，n=6）

2.6 积雪草酸对UC 小鼠结肠组织claudin-1、occludin、ZO-1 表达的影响 结果见图6。与空白组比较，模型组小鼠结肠组织中claudin-1、occludin、ZO-1 阳性细胞表达显著减少（P＜0.01）。与模型组比较，积雪草酸低、高剂量组小鼠结肠组织中claudin-1、occludin、ZO-1 阳性细胞表达明显增加（P＜0.05，P＜0.01）。

3 讨论

目前，溃疡性结肠炎（UC）被认为是一种自身免疫性疾病，其治疗策略以症状为中心，西医常规用药包括抗炎药、免疫抑制剂和生物制剂等，但疗效尚不能令人满意，且存在药物依赖、严重感染等潜在副作用[8]。因此，寻找有效的UC 治疗药物具有重要意义。中医根据UC 特征将其归属为“痢疾”“肠澼”等范畴，认为湿热蕴结于肠道为其主要病机，中医药在治疗UC 方面具有独特优势[9-10]。中药积雪草具有清热利湿、解毒消肿的功效[11]，积雪草酸是其主要有效成分之一[12]。多项研究[13-14]表明，积雪草酸能够促进创面愈合，具有抗肿瘤、 降糖、 抗炎、抗菌等药理作用，对多种炎症性疾病具有治疗作用。本研究发现，积雪草酸对DSS 诱导的UC 小鼠结肠组织损伤具有明显改善作用，并能降低炎症因子水平，改善UC 症状，可能成为潜在的UC 治疗药物。

肠道既是营养物质消化吸收的主要场所，也是人体主要的免疫器官，为抵抗病原微生物和保障机体内环境稳态提供了先天性屏障[15]。肠黏膜屏障由肠上皮层及黏液层组成，是构成肠屏障的物理基础[16]。肠上皮层由肠上皮细胞、能够合成及释放黏蛋白的杯状细胞、合成抗菌肽的Paneth 细胞、产生激素的肠嗜铬细胞以及肠干细胞组成。黏液层位于肠上皮层的上方，主要由杯状细胞分泌的黏蛋白和黏多糖组成，其中黏蛋白占主体部分，而黏蛋白主要由杯状细胞分泌的MUC2 蛋白组成。肠黏膜屏障对于保持肠道完整性具有重要意义，同时也是防止过度免疫反应引起肠道炎症的关键[17]。肠黏膜屏障的破坏会造成肠道中细菌和毒素的易位，从而增加宿主细胞与肠道中细菌、毒素的接触，而细菌的病理性侵袭和定植会进一步刺激机体的免疫反应和多种细胞因子的分泌，促进炎症的发展。上述过程与UC 的发生发展密切相关，而黏液层的减少也是UC 患者最常见的病理特征之一[18]。本研究结果显示，DSS 诱导的UC小鼠结肠组织中杯状细胞结构破坏且数量减少，MUC2 蛋白表达明显下调；而给予积雪草酸干预后，小鼠结肠组织中的杯状细胞结构和数量明显恢复，MUC2 mRNA 及蛋白表达明显上调；提示积雪草酸可能通过保护肠黏膜层对UC 小鼠产生保护作用。

肠上皮细胞通过紧密连接蛋白连接，可防止离子、小分子和细菌等自由穿过[18]。细胞间紧密连接蛋白对维持肠上皮层的通透性至关重要，并且对肠黏膜屏障功能起着决定性作用。紧密连接蛋白主要有跨膜蛋白和胞质支架蛋白2 类，claudin-1 和occludin为2 种跨膜蛋白，具有调节细胞间通透性的作用[19]。ZO-1 是一种胞质支架蛋白，主要调节细胞间物质转运及上皮细胞的极性[20]。临床研究[21]显示，在UC 患者中观察到claudin-1、occludin 和ZO-1 表达下调，并与疾病程度呈负相关。上调紧密连接蛋白的表达有助于保持肠道黏膜屏障的结构完整性，从而预防UC 发生[22]。本研究结果显示，DSS 诱导的UC 小鼠结肠组织claudin-1、occludin 和ZO-1 表达明显下调；而给予积雪草酸干预后，UC 小鼠结肠组织claudin-1、occludin 和ZO-1 表达明显上调；提示积雪草酸可能通过保护肠上皮细胞间紧密连接，进而维持上皮屏障完整性。

综上所述，积雪草酸对DSS 诱导的UC 小鼠结肠组织病理损伤具有明显改善作用，可能与其上调MUC2 及紧密连接蛋白的表达，保护肠道黏膜屏障的完整性有关。