当归补血汤对类风湿关节炎的干预作用及相关网络药理学研究

赵莹，郑秋含，张众，潘志，王颖航 （.长春中医药大学，吉林 长春 307；.长春中医药大学第一附属医院，吉林 长春 307）

类风湿关节炎（Rheumatoid Arthritis，RA）是一种病因未明的自身免疫性疾病[1]。RA 全球平均患病率为0.5%～1.0%，我国的发病率为0.42%[2-3]。RA 的发病机制复杂，涉及遗传、环境、免疫紊乱、细胞因子等多方面，目前临床尚无根治方法，多停留在抑制炎症、缓解症状、延缓病情发展阶段，且临床治愈率较低[4]。探究RA 潜在的治疗方法是近年来的研究热点。

当归补血汤始载于《内外伤辨惑论》，由黄芪和当归组成，用量比为5∶1，其中黄芪扶阳补气、益气补血，当归活血补血，二者合用，气血两旺，对补气生血有协同增效的作用[5]。现代药理学研究[6]表明，当归补血汤具有抗炎、补气生血、调节免疫等功能作用，在RA 的发生和发展中起关键作用。但目前当归补血汤治疗RA 的相关研究及报道较少，因此，本研究利用网络药理学和分子对接技术结合实验验证，以揭示当归补血汤治疗RA 可能的作用机制，为后续的进一步研究及临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 动物 清洁级健康雄性Wistar 大鼠42 只，体质量（200±20）g，购自吉林省长春市亿斯实验动物技术有限责任公司，动物使用许可证号：SYXK（吉）2018-0014，动物生产许可证号：SCXK（吉）2011-0004，饲养于长春中医药大学动物实验中心，温度（23±2）℃，相对湿度（50±5）%。所有动物实验按照长春中医药大学动物实验伦理委员会相关规定执行，批准号：2021361。

1.2 药物及试剂 当归、黄芪，购自长春吉林大药房，批号分别为：200407、28122068，经长春中医药大学蔡广知副教授鉴定为正品；雷公藤多苷片，上海复旦复华药业有限公司，国药准字Z31020415，批号：20191204；氨基甲酸乙酯，天津百伦斯生物技术有限公司，批号：20190807；牛Ⅱ型胶原，美国Chondrex 公司，批号：220241；弗氏完全佐剂，美国Sigma 公司，批号：SLCJ4383；乙酸溶液，批号：20210309；基质金属蛋白酶-9（matrixmetalloproteinase-9，MMP9）抗体（批号：A0289）、HIF-1α 抗体（批号：A11945）、血管内皮生长因子（VEGFA）抗体（批号：A5708），美国ABclo nal 公司）；GAPDH抗体，美国Bioworld 公司，批号：AP0063；Goat anti-Rabbit IgG（H＆L）-HRP，北京博奥森生物技术有限公司，批号：AF12114126；BCA 蛋白浓度测定试剂盒，上海碧云天生物技术公司，批号：120219200821；ECL 发光液，美国Beyotime 公司，批号：P0018AS。

1.3 仪器 165-8000 型电泳仪、170-3930 型转膜仪，美国Bio-Rad 公司；FL1000 型智能成像系统，美国Thermo Fisher Scientific 公司；3H16RI 高速冷冻离心机，湖南赫西仪器装备有限公司。

1.4 网络药理学分析

1.4.1 当归补血汤的活性成分和潜在靶点的获取和筛选 通过中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP，http://lsp.nwu.edu.cn/tcmspsearch.php）检索当归、黄芪的活性成分和潜在靶点[7]。以口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）≥30%和类药性（Drug-Likeness，DL）≥0.18 为条件筛选，去重。通过Uniprot 数据库（http://www. Uniprot.org/）进行标准化处理，最终确定当归补血汤的活性成分和潜在靶点[8]。

1.4.2 RA 疾病相关靶点及药物-疾病共同靶点的获取利用DisGeNET（http://www.Dis Ge NET.org/home/）、DrugBank（https://www.drugbank.ca）和TTD（http://bidd.nus.edu.sg/group/cjttd） 数 据 库 以 “Rheumatoid Arthritis”为检索词条，获取RA 疾病靶点[9-11]。将获取的靶点进行合并、去重，通过Uniprot 数据库将所得靶点进行标准化处理。将当归补血汤潜在靶点与RA 疾病靶点导入Venny 2.1.0 平台（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny），获得两者的交集靶点。

1.4.3 构建“药物-活性成分-疾病-靶点”网络图将药物、药物的活性成分、疾病以及药物与疾病的交集靶点之间的相互对应关系导入Cytoscape 3.6.1 软件中，构建“药物-活性成分-疾病-靶点”网络图，并进行相关拓扑学分析。在此网络图中，节点（node）代表药物、活性成分、疾病和交集靶点；边（edge）代表药物的活性成分、疾病与其作用靶点之间的关系；与节点直接相连的其他节点的数目称为该节点的度值（degree），节点的度值越大，该节点所代表的活性成分或者靶点在交集网络中越重要。通过该网络图可进一步明确当归补血汤治疗RA 的核心活性成分。

1.4.4 构建当归补血汤与RA 交集靶点的蛋白互作（protein-protein interaction，PPI）网络图 将当归补血汤与RA 的交集靶点导入STRING 数据库（http://string-db.org）[12]，物种设置为“Homo sapiens”，构建PPI 网络图。通过Cytoscape 3.6.0 软件中“CytoNCA”插件分析拓扑网络的度值（Degree Centrality，DC）、介数中心性（Betweenness Centrality，BC）、接近中心性（Closeness Centrality，CC）、特征向量中心性（Eigenvector Centrality，EC），将高于各值中位数的靶点定义为当归补血汤治疗RA 的核心作用靶点。

1.4.5 GO 与KEGG 富集分析 将当归补血汤与RA的交集靶点导入DAVID 数据库（https://david.ncifcrf.gov/）[13]，进行基因功能注释（Gene Ontology，GO）和京都基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析，并使用微生信网站绘制气泡图和条形图。

1.4.6 当归补血汤核心活性成分与核心靶点的分子对接 将当归补血汤主要活性成分与核心靶点进行分子对接，首先通过PubChem 数据库（http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）获得化合物的SDF 格式文件，使用Chem3D 软件对结构进行优化并获得3D 结构的mol2格式文件。通过PDB 数据库（http://www.rcsb.org/pdb）获得核心靶点的受体蛋白VEGFA（PDB：1BJ1）、HIF-1α（PDB：1H2K）、MMP9（PDB：1GKC），使用PyMOL 2.5 软件对受体蛋白进行去除水分子和小分子配体。使用Auto Dock Tools 1.5.6 软件对靶点的受体蛋白与配体化合物进行PDBQT 格式转换。最后利用AutoDock Vina 1.1.2 进行分子对接并用PyMOL 2.5 进行可视化分析。

1.5 当归补血汤治疗RA 的体内实验验证

1.5.1 药物的配制、实验分组、造模及给药 当归补血汤按原方黄芪与当归5∶1 称取，煎煮浓缩至水煎液浓度为含生药量1.5 g·mL-1，即当归补血汤高剂量组；同法制备当归补血汤中（7.5 g·kg-1）、低（3.75 g·kg-1）剂量水煎液。42 只Wistar 大鼠按照随机数字表分为空白组、模型组、雷公藤多苷组及当归补血汤低、中、高剂量组，每组7 只。适应性饲养1 周后，在大鼠右后足趾皮内注射0.1 mL 胶原乳剂，进行初次免疫。第7 天进行二次免疫，免疫方法与初次免疫方法相同，建立类风湿关节炎常用的胶原诱导性（CIA）模型[14]。二次免疫1 周后，雷公藤多苷组（9.45 mg·kg-1）及当归补血汤低、中、高剂量组进行灌胃治疗，空白组与模型组给予等量生理盐水，每周记录关节肿胀程度，周期为6 周。

1.5.2 大鼠关节炎指数（AI）评分 采用关节炎指数积分评价其关节炎症程度。于初次免疫前观察1 次，之后每周观察1 次足爪肿胀情况，同时对足爪炎症进行评分，采用5 分制的评分标准[15]。0 分，无皮肤红肿关节症状；1 分，脚踝或足部发红轻度肿胀；2 分，脚踝和足部发红轻度肿胀；3 分，脚踝和足部发红，踝关节和跖关节中度肿胀；4 分，整个踝关节、足部和足底红肿严重。此外，出现尾部红斑或前肢肿胀分别计0.5 分。关节炎严重程度由三位独立观察者目测评估，观察者不知道实验分组。

1.5.3 Western Blot 法检测滑膜组织中相关蛋白表达水平 配制20%的氨基甲酸乙酯，按照7 mL·kg-1的剂量腹腔注射麻醉大鼠，腹主动脉取血后截取大鼠膝关节，用剪刀去除关节表面的皮肤和肌肉组织，取各组大鼠的关节滑膜组织并剪碎，分别加入RIPA裂解液提取蛋白，采用BCA 蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度。制备12% SDS-PAGE 凝胶，上样后进行电泳、转膜、封闭，TBST 洗涤，4 ℃过夜孵育HIF-1α（1∶1 000）、VEGFA（1∶1 000）、MMP9（1∶1 000）及GAPDH（1∶2 000）一抗；次日TBST 洗涤，室温摇床上孵育二抗（1∶1 000）1 h；TBST 洗膜，滴加化学发光液（ECL）显色，采用ImageJ 图像分析软件分析各条带灰度值，以GAPDH 为内参，对目的蛋白进行半定量分析。

1.5.4 统计学处理方法 通过SPSS 19.0 软件进行分析，结果以均数± 标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析（One way ANOVA），两两比较采用t检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 当归补血汤的活性成分和潜在靶点 见表1。共获取当归补血汤活性成分17 个。黄芪对应靶点376 个、当归55 个，去除重复靶点，最终获得193 个当归补血汤治疗RA 的潜在靶点。

表1 当归补血汤活性成分基本信息Table 1 Basic information of active components of Danggui Buxue Decoction

2.2 RA 的疾病靶点及药物-疾病共同靶点 见图1。在DisGeNET、DrugBank 和TTD 数据库分别获得RA疾病靶点2 723 个、594 个和147 个，进行合并、去重，最终共获得2 883 个RA 疾病靶点。通过Venny 2.1.0 平台共获得129 个当归补血汤治疗RA 的作用靶点，即与绿色相交部分，其中黄芪治疗RA 的可能靶点128 个，当归治疗RA 的可能靶点20 个。

图1 当归补血汤与类风湿关节炎（RA）交集靶点的韦恩（Venny）图Figure 1 Venny diagram of intersection target of Danggui Buxue Decoction and rheumatoid arthritis（RA）

2.3“药物-活性成分-疾病-靶点”网络图分析 通过“1.4.3”项下方法构建“药物-活性成分-疾病-靶点”网络图，见图2，并进行相关拓扑学分析。在此网络图中，共有149 个节点，426 条边。其中红色圆形节点表示RA，蓝色菱形节点表示当归补血汤治疗RA 潜在作用靶点，绿色和黄色正方形节点表示黄芪、当归，绿色和黄色正六边形节点表示黄芪、当归的活性成分。节点面积越大代表连接度值越大，其中度值最高的活性成分是HQ15 槲皮素（quercetin）。

图2 当归补血汤治疗类风湿关节炎的“药物-活性成分-疾病-靶点”网络图Figure 2 Network diagram of“drugs-active components-disease-target”of Danggui Buxue Decoction in the treamtent of rheumatoid arthritis（RA）

2.4 PPI 网络分析和核心靶点筛选 通过“1.4.4”项下方法构建当归补血汤治疗RA 的PPI 网络图（图3），共有129 个节点、2 566 条边。利用Cytoscape 3.6.0软件中的“CytoNCA”插件进一步拓扑分析，获得当归补血汤治疗RA 的AKT1、VEGFA、IL-6、HIF-1α和MMP9 等27 个核心靶点，见图4。选取影响关节滑膜环境的VEGFA、HIF-1α 和MMP9 作为关键靶点进行后续研究。

图3 当归补血汤治疗类风湿关节炎（RA）的PPI 网络图Figure 3 PPI network diagram of Danggui Buxue Decoction in treating rheumatoid arthritis（RA）

2.5 GO 功能与KEGG 通路富集分析 按“1.4.5”项下方法对当归补血汤治疗RA 的交集靶点进行GO富集分析，获得生物过程（Biological Processes，BP）714 条、细胞组成（Cellular Components，CC）65 条、分子功能（Molecular Functions，MF）139 条。根据富集基因数量降序排序，选取每个类别的前10 条绘制条形图进行可视化分析，见图5。

图5 当归补血汤治疗类风湿关节炎（RA）的GO 富集分析Figure 5 GO enrichment analysis of Danggui Buxue Decoction in treating rheumatoid arthritis（RA）

对当归补血汤治疗RA 的交集靶点进行KEGG 通路富集分析，获得171 条通路，根据富集基因数量降序排序，选取富集基因数最多的前20 条，绘制气泡图，见图6。结果主要涉及RA 中的PI3K-Akt 信号通路（PI3K-Akt signaling pathway）、AGE-RAGE 信号通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）、MAPK 信号通路（MAPK signaling pathway）、白细胞介素17 信号通路（IL-17 signaling pathway）和肿瘤坏死因子信号通路（TNF signaling pathway）等。

图6 当归补血汤治疗类风湿关节炎（RA）的KEGG 通路富集分析图Figure 6 KEGG pathway enrichment analysis of Danggui Buxue Decoction in treating rheumatoid arthritis（RA）

2.6 当归补血汤主要活性成分与核心靶点的分子对接结果 将当归补血汤的关键活性成分槲皮素与核心靶点VEGFA、HIF-1α、MMP9 进行分子对接，结合能见表2。槲皮素与3 种核心靶点VEGFA、HIF-1α、MMP9 结合能值均＜-7.0 kcal·mol-1，说明具有强烈的结合活性，结合构象稳定。通过AutoDock Vina 1.1.2 和PyMOL 2.5 对槲皮素与核心靶点VEGFA、HIF-1α、MMP9 进行相互作用结合模式分析，见图7。

图7 槲皮素与核心靶点VEGFA、HIF-1α、MMP9 可视化分子对接模拟图Figure 7 Visual simulation diagram for molecular docking of quercetin to core targets VEGFA，HIF-1 α，MMP9

表2 槲皮素与核心靶点VEGFA、HIF-1α、MMP9 的结合能Table 2 Binding energy of quercetin and core targets VEGFA，HIF-1 α，MMP9

2.7 当归补血汤对CIA 大鼠关节炎评分的影响 结果如表3 所示，与空白组比较，自第2 周起，造模大鼠关节炎评分明显升高（P＜0.01）；与模型组比较，自第3 周起，各给药组大鼠关节炎评分开始呈逐渐降低趋势，第3 周当归补血汤高剂量组明显降低（P＜0.05）；至第6 周，各给药组的关节炎评分均明显降低（P＜0.05，P＜0.01）。

表3 当归补血汤对胶原诱导性（CIA）大鼠关节炎评分的影响（±s，n=6）Table 3 Effect of Danggui Buxue Decoction on arthritis score of collagen-iduced arthritis（CIA） rats（±s，n=6）

表3 当归补血汤对胶原诱导性（CIA）大鼠关节炎评分的影响（±s，n=6）Table 3 Effect of Danggui Buxue Decoction on arthritis score of collagen-iduced arthritis（CIA） rats（±s，n=6）

注：与空白组比较，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01

组别空白组模型组雷公藤多苷组当归补血汤低剂量组当归补血汤中剂量组当归补血汤高剂量组关节炎评分/分第2 周0 4.43±0.49**4.43±0.49**4.57±0.49**4.43±0.49**4.57±0.49**第3 周0 4.71±0.45**4.29±0.45 4.57±0.49 4.29±0.45 4.14±0.34#第4 周0 4.29±0.45**3.71±0.45##4.14±0.35 4.14±0.33 3.86±0.35#第5 周0 4.14±0.35**3.14±0.35##3.71±0.45 3.57±0.49#3.29±0.45##第6 周0 3.86±0.35**2.57±0.49##3.26±0.45#3.29±0.45##2.86±0.63##

2.8 当归补血汤对CIA 大鼠滑膜组织中VEGFA、HIF-1α 和MMP9 蛋白表达水平的影响 结果见图8，与空白组比较，模型组VEGFA、HIF-1α 和MMP9蛋白表达水平均明显升高（P＜0.01）；与模型组比较，雷公藤多苷组及当归补血汤低、中、高剂量组VEGFA、HIF-1α 和MMP9 的蛋白表达水平均明显降低（P＜0.01）。

图8 当归补血汤对胶原诱导性（CIA）大鼠膝关节滑膜HIF-1α、VEGF、MMP-9 蛋白表达的影响（±s，n=6）Figure 8 The effect of Danggui Buxue Decoction on the protein expressions of HIF-1α，VEGF and MMP-9 in the knee synovium of CIA rats（±s，n=6）

3 讨论

类风湿关节炎（RA）的主要病理特征为滑膜炎性细胞及炎性因子浸润、滑膜细胞过度增殖、新生血管形成及软骨和骨质不可逆破坏[16-17]。VEGFA 是一种重要的促血管生成因子，可与滑膜血管内皮上的受体结合，通过信号转导，最终导致大量新生血管的产生，在RA 的发病机制中发挥重要作用[18]。HIF-1α 是组织参与缺氧调控的重要核转录因子，在低氧条件下，胞内HIF-1α 蛋白大量积聚，并从胞浆进入细胞核内参与调控下游靶基因VEGFA 的转录过程，使VEGFA 表达上调，进而促进炎性细胞因子分泌、增加血管通透性、加速血管内皮细胞增殖，导致血管翳形成，影响RA 的发病和病情进展[19-20]。基质金属蛋白酶（Matrix metallopmteinases，MMPs）是降解细胞外基质的一种锌蛋白酶，可加重关节疼痛、肿胀、骨侵蚀和软骨破坏等，其中MMP9 主要参与骨侵蚀[21]。最新研究[22]表明，VEGFA 能影够响MMPs的表达，且VEGFA 在RA 关节液中的表达与MMP9的表达密切相关。因此，通过影响HIF-1α 及其下游靶基因VEGFA、MMP9 的表达，对控制RA 病情的发展和调节RA 病理过程起着重要作用。

本研究通过网络药理学、分子对接技术和体内动物实验，对当归补血汤防治RA 的潜在作用机制进行了初步探讨，共筛选出当归补血汤活性成分17 个、潜在靶点193 个，共涉及171 条主要的通路以及918 个生物过程。根据构建“药物-活性成分-疾病-靶点”网络图推测出当归补血汤治疗RA 的主要活性成分包括槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇等，其中槲皮素的连接度值最高。根据PPI 网络与KEGG 通路富集分析得出当归补血治疗RA 涉及AKT1、VEGFA、IL-6、HIF-1α、MMP9 等多个核心靶点以及PI3KAkt、AGE-RAGE、TNF、MAPK 等多条信号通路。利用分子对接技术进行初步验证，结果显示当归补血汤主要活性成分槲皮素与3 种核心靶点VEGFA、HIF-1α、MMP9 都有强烈的结合活性。初步表明当归补血汤可通过调节VEGFA、HIF-1α、MMP9 的表达干预RA 的疾病进程，发挥抗RA 作用。

为进一步验证上述观点，本研究建立了类风湿关节炎常用的胶原诱导性（CIA）模型进行体内实验。研究结果显示，当归补血汤干预后的大鼠关节炎评分明显降低，其关节肿胀度明显改善。此外， Western Blot 结果显示，CIA 大鼠关节滑膜组织中HIF-1α、VEGFA 和MMP9 蛋白表达明显升高，给予当归补血汤干预后，大鼠滑膜组织中HIF-1α 蛋白表达下降，对下游靶基因VEGF 的激活效应减弱，使VEGFA 表达降低，抑制新生血管的生成，减少血管内皮细胞释放NO，从而降低MMP9 蛋白表达，缓解关节炎大鼠的骨破坏，减轻关节的损伤，对RA 起到治疗作用。

综上所述，本研究基于网络药理学分析当归补血汤治疗RA 的可能作用机制，并通过分子对接技术预测结合体内实验进行验证。结果表明，当归补血汤通过影响HIF-1α 及其下游靶基因VEGFA、MMP9的表达，抑制RA 血管翳的形成，防止骨破坏，从而对RA 起到治疗作用。本研究仅对RA 发病过程中的核心靶点进行研究，与其相互交联的信号通路有待进一步探索，可为后续研究方向提供参考依据。