基于网络药理学和分子对接探析三黄泻心汤加味治疗上消化道出血的作用机制※

方灶军 王 倩

(上海中医药大学附属曙光医院急诊内科,上海 230012)

上消化道出血(upper gastrointestinal bleeding,UGIB)即十二指肠悬韧带以上的消化道出血,是临床上常见的危害患者健康的急症之一,具有高发病率、高死亡率、起病急、进展快等特点。因此,对于该病的治疗需要及时且有效。西药治疗UGIB主要是积极止血、抑制胃酸分泌、修复受损黏膜,具有吸收快、起效快等特点,但西药易引起不良反应[1-2],如头晕乏力、恶心呕吐、白细胞减少、便秘、腹泻等,不利于患者预后。而中药在治疗UGIB中可显著减少不良反应发生[3]。

UGIB归属于中医 “血证”“吐血”“便血”等范畴。中医学认为,UGIB的本质是络伤血溢[4]。根据多数学者的观点[5],络伤血溢主要责之于“热”和“虚”。“热”者,包括胃热、肝火、阴虚火旺,主要由情志不遂、饮食不节所致;因热盛伤津伤络,迫血妄行而离经成瘀,临床表现为胃脘灼热疼痛,血色鲜红,口苦,便秘,出血臭秽,舌红,苔黄,脉滑。对于该类患者当治以清热解毒、凉血止血,予三黄泻心汤加味[6]。

三黄泻心汤出自《金匮要略》,由黄连、黄芩、大黄组成,主要作用为清热解毒、凉血止血。本研究采用中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP)筛选出三黄泻心汤加味中6味中药的化学活性成分及相应靶点,而后于Gene Gards、OMIM、Pharmgkb及DrugBank数据库中检索UGIB靶点,并将二者靶点相交,作蛋白质-蛋白质相互作用(PPI) 网络分析并分别筛选关键化学成分核心靶点,进行基因本体(Gene Ontology, GO)富集分析和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析,最后对关键化学成分及靶点分子进行分子对接。最终对三黄泻心汤加味治疗UGIB的有效成分及靶点进行预测,探讨其产生作用的信号通路,对三黄泻心汤加味治疗UGIB的作用机制提供新思路。

1 资料与方法

1.1 三黄泻心汤加味活性成分筛选 通过检索TCMSP[7]搜索出三黄泻心汤加味中6味中药单药(黄连、黄芩、大黄、白及、侧柏炭、仙鹤草)的活性成分,活性成分中的有效化合物筛选标准设定为口服利用度(oral bioavailability,OB)≥30%,类药性(drug-likeness,DL)≥0.18,由此得到符合条件的活性成分靶点信息。最后,通过UniPort(https://www.uniprot.org/)规范靶点信息[8-9]。

1.2 UGIB疾病靶点筛选 以“Upper gastrointestinal bleeding”为关键词,通过Gene Cards数据库、OMIM数据库、Pharmgkb数据库和DrugBank数据库搜集UGIB的疾病靶点,合并4个数据库靶点,并绘制韦恩(Venn)图。

1.3 中药-活性成分-靶点网络图的构建及网络拓扑分析 通过Bioinformatics &Evolutionary Genomics(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)在线工具对得到的三黄泻心汤加味活性成分靶点和疾病相关靶点进行筛选,获得两者交集靶点,将得到的交集靶点导入Cytoscape 3.9.0软件[10]。通过Cytoscape 3.9.0软件构建出中药-活性成分-靶点网络图,然后运用该软件的Network Analyzer功能进行网络拓扑分析。网络中的节点以度值(Degree)为单位表示[11],其自由度的高低通过节点靶点的大小展示。

1.4 构建PPI网络,筛选关键靶点 将交集靶点导入至STRING数据库(https://www.string-db.org/)[11],限定物种为“Homosapiens”,设置minimum required interaction score为highest confidence (0.900),构建PPI网络,得到交集靶点的PPI网络信息,获取相关生物过程、分子作用和通路信息。通过Cytoscape 3.9.0的Cyto NCA插件进行拓扑分析,以介数中心性(betweenness centrality,BC)、接近中心性(closeness centrality,CC)、度中心性(degree centrality,DC)、特征向量中心性(Eigenvector centrality,EC)、局部连通性(local average connectivity-based method, LAC)、网络中心性(network centrality, NC)等条件筛选出关键靶点 ,利用Cytoscape 3.9.0软件将其可视化。

1.5 交集靶点基因富集分析 将交集靶点导入DAVID数据库,进行GO富集分析和KEGG通路富集分析,用R软件Bioconductor库进行绘图将其可视化。筛选标准为P<0.05、Q<0.05、物种为Homo sapiens,输出结果按照QValue或PValue值排序并将其可视化。GO富集分析按照生物过程(biological process,BP)、细胞组分(cellular component, CC)、分子功能(molecular function,MF)3个方面输出前10位结果, KEGG富集分析输出前30位结果,并通过条形图、气泡图将其可视化[12]。

1.6 分子对接验证 首先从PDB数据库下载关键靶点蛋白3D结构,从TCMSP下载活性成分的MOL2文件,然后通过PyMOL软件对关键靶点蛋白结构进行加氢、去除水分子等操作,利用AutoDock Tools 1.5.6、AutoDock Vina对关键靶点蛋白和主要活性成分进行分子对接,记录结合能,并用PyMol对部分结果进行可视化。

2 结果

2.1 三黄泻心汤加味活性成分筛选及潜在作用靶点收集 通过TCMSP检索到符合筛选标准的三黄泻心汤加味活性成分共有87个,其中黄连14个,黄芩36个,大黄16个,白及9个,侧柏炭7个,仙鹤草5个。然后将得到的活性成分预测作用靶点导入到UniProt数据库进行标准化,删除重复值,最后得到靶点基因共183个。

2.2 UGIB靶点收集 利用Gen Cards、OMIM、DrugBank、PharmGkb疾病数据库分别获得潜在靶点3319个、10个、50个、6个,整合后共有3385个,删除重复值,最后得到3350个UGIB相关靶点。见图1。

图1 疾病靶点韦恩图

2.3 中药-活性成分-靶点网络图构建及网络拓扑分析 三黄泻心汤加味靶点183个和疾病相关靶点3350个进行重复比较,最终得到141个交集靶点,说明三黄泻心汤可通过141个靶点作用于UGIB。通过Cytoscape 3.9.0软件构建出中药-活性成分-靶点网络图。网络拓扑分析结果:该网络共包括204个节点(63个成分节点,141个靶点节点)和 738 条边,节点平均自由度为 7.235。做网络拓扑分析的时候,按照Degree值由大到小排列,选取排名前10的活性成分。见图2、3,表1。

表1 活性成分排名前10信息(按Degree值排序)

图2 三黄泻心汤加味与疾病靶点韦恩图

表格成分节点中绿色正方形代表靶点,圆形代表药物活性成分(灰色代表白及,黑色代表侧柏叶,黄色代表大黄,紫色代表黄连,红色代表黄芩,蓝色代表仙鹤草)。

2.4 PPI网络分析 将2.3中获得的141个交集靶点导入至STRING数据库存进行PPI分析,得到PPI网络图。将PPI关系导入Cytoscape 3.9.0软件,运用 CytoNCA 插件进行网络拓扑分析结果显示:该网络 BC、CC、DC、EC、LAC、NC中位数分别为13.9、0.6、24、0.16、12.86、14.44,提取这些参数均大于中位数的节点共15个;再次进行子网络拓扑分析,以同样的方法提取核心节点4个,分别为ESR1、MYC、TP53 和 HIF1A,表明这些基因在三黄泻心汤加味治疗UGIB的过程中具有重要意义。见图4、5。

图4 PPI网络图

图5 核心靶点筛选

2.5 GO功能富集与KEGG通路富集分析 将141个交集靶点用 R 软件进行 GO 富集分析,共得到 2149个BP条目,63 个CC条目,179 个MF条目(结果均满足P<0.05 且Q<0.05)。分别对3个方面QValue排名前10的条目进行可视化。在BP分析中,主要涉及对氧化应激的反应(response to oxidative stress)、细胞对化学应激的反应(cellular response to chemical stress)、对药物的反应(response to drug)、对氧含量的反应(response to oxygen levels)等。在CC分析中,主要涉及膜筏(membrane raft)、膜微区(membrane microdomain)、转移酶复合物,转移含磷基团(transferase complex,transferring phosphorus containing groups)、蛋白激酶复合物(protein kinase complex)等。在MF分析中,主要涉及DNA结合转录因子结合(DNA binding transcription factor binding)、泛素样蛋白连接酶结合(ubiquitin like protein ligase binding)、RNA聚合酶Ⅱ特异性DNA结合转录因子结合(RNA polymerase Ⅱ specific DNA binding transcription factor binding)、泛素蛋白连接酶结合(ubiquitin protein ligase binding)、丝氨酸水解酶活性(Serine Hydrolase Activity)等。

KEGG富集分析共得到168个条目(结果均满足P<0.05 且Q<0.05),对其按QValue 排名前 30 的结果进行可视化。主要富集通路有:脂质与动脉粥样硬化(lipid and atherosclerosis)、流体剪切应力与动脉粥样硬化(fluid shear stress and atherosclerosis)、前列腺癌(prostate cancer)、膀胱癌(bladder cancer)、内分泌抵抗(endocrine resistance)、小细胞肺癌(small cell lung cancer)、白细胞介素17(IL-17)、信号通路(IL-17 signaling pathway)、肿瘤坏死因子信号通路(TNF signaling pathway)、丙型肝炎(hepatitis C)、人类巨细胞病毒感染(human cytomegalovirus infection)、胰腺癌(pancreatic cancer)、麻疹(measles)、细胞衰老(cellular senescence)、非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer)、p53信号通路(p53 signaling pathway)、弓形体病(toxoplasmosis)、P13K-Akt信号通路(P13K-Akt signaling pathway)、癌症中的蛋白多糖(proteoglycans in cancer)、结肠直肠癌(colorectal cancer)、铂耐药性(platinum drug resistance)、肝细胞癌(hepatocellular carcinoma)、恰加斯病(chagas disease)等。结果表明,三黄泻心汤加味的活性成分靶点分布于不同的信号通路,说明三黄泻心汤加味可以通过对多条通路的调节作用达到治疗UGIB的目的。见图6、7。

图6 GO富集分析图

图7 KEGG富集分析图

2.7 关键成分与靶点蛋白的分子对接分析 三黄泻心汤加味排名前3的活性成分为槲皮素、木犀草素、山柰酚,同时由PPI的结果可知基因ESR1、MYC、TP53、HIF1A为关键靶点,故利用AutoDock Vina对上述3种活性成分与4个靶点蛋白进行对接,验证化合物和靶点的结合活性。对结合能统计可知平均结合能为-7.7 kcal/mol,均小于-5 kcal/mol,表明关键靶点与化合物之间具有较强的结合活性。然后用 PyMOL 软件对部分对接结果进行可视化,直观展示其构象关系,从图表发现这些蛋白和化合物结合至少形成了一个氢键相互作用力,使他们能够稳定的结合。因此,三黄泻心汤加味可能通过以上关键靶点干预UGIB的相关通路,达到改善或者治疗UGIB的作用。见表2、图8。

表2 三黄泻心汤加味关键成分与靶点蛋白分子对接信息 (kcal/mol)

图8 分子对接图

3 讨论

三黄泻心汤加味方中以大黄为君药,黄芩、黄连共为臣药,白及、侧柏炭、仙鹤草为佐药,六药配伍重在泻火,佐以止血。其中大黄有清热泻火通肺之效,黄连有泻心清胃、燥湿解毒的功效,黄芩有泻肺燥湿的功效,可提升泻火清热的效果,仙鹤草收敛止血,兼解毒补虚,白及收敛止血,消肿生肌,侧柏炭凉血以止血,全方可达到清热止血、泻火化瘀之效,实现不止血而血自止的效果。现代药理研究显示[13],三黄泻心汤加减可对内源性凝血系统产生作用,达到止血效果,同时可抑制胃蛋白酶活性,以保护胃黏膜;大黄对改善血管脆性效果明显,可通过增强毛细血管通透性,加速血管收缩活性,促使血液凝固;此外,大黄对胃黏膜还具有修复作用。因此在UGIB治疗中联合应用三黄泻心汤加味可提升止血效果,同时对受损的胃黏膜进行修复。

本研究以三黄泻心汤加味的化学成分、靶点及通路信息等多项数据,构建网络对其功能分析,系统预测其对UGIB可能分子机制。UGIB的病因主要为非静脉曲张性上消化道出血(non-variceal upper gastrointestinal bleeding ,NVUGIB)和食管胃底静脉曲张出血(esophageal and gastric varices bleeding ,EGVB)[14]。

NVUGIB 通常是由消化性溃疡引起,这通常与幽门螺杆菌(helicobacter pylori,HP)感染、非甾体抗炎药有关。EGVB 是由食管或胃静脉曲张破裂引起,通常与慢性肝病和(或)门静脉高压有关。各病因均涉及多个功能蛋白和代谢通路。本研究发现三黄泻心汤加味中的141个靶点与UGIB的治疗密切相关,筛选得到前10个关键活性成分为: 槲皮素、木犀草素、山柰酚、汉黄芩素、黄芩素等,并且通过PPI网络图分析可知侧柏叶、仙鹤草、黄连主要通过ESR1、MYC、TP53 、HIF1A靶点发挥作用。分析可得槲皮素是三黄泻心汤加味的主要活性成分,存在于侧柏叶、仙鹤草、黄连中,研究表明槲皮素[15]可能是通过调节信号通路的活性和基因表达来对人类健康产生影响,槲皮素对神经退行性疾病、肝脏疾病和糖尿病具有有益作用,其中PI3K/Akt 是与槲皮素最相关的途径。山柰酚[16]通过调节AMPK、NOX4、核因子κB及Notch信号通路起到抗氧化应激、抑制胞外基质积聚、抗肿瘤、抗病毒、抗炎、抗菌、增强机体免疫等多种作用。由此可见,三黄泻心汤加味对治疗UGIB的相关活性成分可能是通过多途径同时调控各信号通路。

分子对接结果显示关键活性成分与核心靶点蛋白的结合能均<-5 kcal/mol,提示其结合比较稳定,证实了三黄泻心汤加味对治疗UGIB的靶向作用。

综上所述,本研究通过网络药理学的方法,初步阐明三黄泻心汤加味治疗UGIB的潜在活性成分、关键靶点、关键通路,并对主要活性成分和关键靶点蛋白进行分子对接,验证了分析结果。结果提示,三黄泻心汤加味可通过多靶点、多通路、多方向对UGIB产生治疗作用,延缓其进展,关键靶点及主要通路可成为未来治疗UGIB的方向。