心火脾虚证型特应性皮炎患者肠道菌群差异共代谢产物初探

杨贤平,乐元,平瑞月,梁家芬,李红毅

特应性皮炎(atopic dermatitis, AD)是一种慢性复发性、炎症性、瘙痒性皮肤病,常表现为皮肤湿疹样改变,干燥伴剧烈瘙痒。中医学认为AD是由于先天禀赋不足、脾失健运、素体偏热,加上外感六淫、后天饮食失节等多种因素所致。正如《素问·至真要大论》载:“诸湿肿满,皆属于脾;诸痛痒疮,皆属于心”,心火脾虚的病机贯穿本病始终。本团队在多年的临床实践和科研中,验证了这一观点,并在此基础上对心火脾虚型AD患者及动物模型开展了多项研究[1-5]。

目前,AD的发病机制仍未完全明确。越来越多的研究[6-7]表明,肠道微生态失调在过敏性疾病的发生发展中扮演着重要角色。肠道菌群水平及其共代谢产物与AD发病机制和严重程度之间存在着密切而复杂的联系[8-10]。前期研究[11]发现,心火脾虚型AD患者肠道菌群alpha多样性较健康患者偏高,在部分菌群丰度上与健康对照存在差异。然而至今仍鲜有对AD患者肠道菌群共代谢产物的相关研究[12-13],AD患者肠道菌群共代谢谱仍未能完全了解。因此,笔者将基于超高效液相色谱-质谱的代谢组学检测分析方法,初步探索鉴定心火脾虚证型AD患者肠道菌群差异共代谢产物,为之后探索AD的病理机制提供依据。

1 研究对象与方法

1.1研究对象 招募2020年6月—2020年12月于广东省中医院皮肤科门诊就诊的心火脾虚型AD受试者20例,同时招募正常体检的健康志愿者20例。记录受试者与志愿者的年龄、性别等人口学信息。该试验获得了广东省中医院伦理委员会(ZE2020-072-01)的伦理批准。

1.2诊断标准 AD患者参考Williams诊断标准[14]。辨证诊断标准参考《特应性皮炎中医诊疗方案专家共识》[15]。由两位具有执照的中医医师对AD患者进行辨证,以确保其统一性和权威性。

1.3纳入标准 ①符合诊断标准的AD患者;②中医辨证为心火脾虚证;③同意并签署知情同意书。

1.4排除标准 ①过去6个月内系统应用过益生菌、抗生素、免疫抑制剂;②过去1个月内系统应用过糖皮质激素;③过去2周内外用糖皮质激素及免疫抑制剂治疗;④过去2周内口服中药治疗;⑤无法完成本研究全过程的患者。

1.5粪便标本采集 入组的受试者和志愿者均按照要求采集粪便标本。粪便标本采集后联系课题研究员并同城快递送至广东省中医院,在5 h内保存至医院标本库-80 ℃的环境中。

1.6代谢物的提取和检测

1.6.1样品制备 从-80 ℃的冰箱中取出粪便样本于冰上解冻。待粪便样本解冻到没有冰块后,称量50 mg(±1 mg)样本放至2 mL离心管中,并向离心管中加入500 μL 70%甲醇内标提取液,涡旋3 min混匀后,静置于-20 ℃冰箱中30 min。在4 ℃的条件下,以12 000 r/min的转速离心10 min后,取250 μL上清液于1.5 mL EP管中,把上清液以12 000 r/min的转速离心5 min后,取150 μL上清液于对应进样瓶内衬管中,用于上机分析。

1.6.2色谱采集条件 非靶向检测数据采集仪器系统主要包括超高效液相色谱(ultra performanceli-quidchromatography, UPLC)和四级杆飞行时间质谱(quadrupole-time of flight)。广泛靶向检测数据采集仪器系统主要包括UPLC和串联质谱(tandem mass spectrometry, MS/MS)。所有粪便样本提取液进行等量混合后,进行基于液相色谱、四级杆飞行时间质谱和串联质谱法(liquid chromatography-quadrupole time of flight-tandem mass spectrometry, LC-QTOF-MS/MS)的实验。

1.6.3样本的质控分析 由所有样本提取物混合制备成质控(quality control,QC)样本,在每10个检测分析样本中插入一个QC样本,用于样本在相同的处理方法下的可重复性监测分析。

1.7数据处理和分析

1.7.1多元统计变量分析 用R语言软件的内置统计prcomp函数,设置函数参数scale=True,对数据进行单位方差标度(unit variance scaling,UV)归一化,进行主成分分析(principal component analysis,PCA)。同时采用正交偏最小二乘判别分析(orthogonal partial least squares-discriminant analysis,OPLS-DA)方法,使模型变得简单易懂,可视化效果更明显。

1.7.2差异代谢产物的筛选 基于OPLS-DA结果,利用R语言软件的MetaboAnalystR package可以初步筛选出两组间的差异代谢物。同时结合单变量分析的P-value或者差异倍数值(fold change)来进一步筛选出显著差异代谢物。若为无生物学重复样本比较,则根据fold change值进行差异筛选。若为有生物学重复样本比较,则采取将fold change和OPLS-DA模型的变量重要性投影(variable importance in projection,VIP)值相结合的方法来筛选差异代谢物。筛选标准:①代谢物在对照组和实验组中差异为2倍以上或0.5以下(fold change≥2或fold change≤0.5),则认为差异显著。②若样品分组存在生物学重复,在①的基础上,再选取VIP≥1的代谢物,则认为差异显著。将筛选得到的差异代谢产物利用R语言软件绘制火山图。

1.7.3通路注释及富集分析 将差异代谢产物利用基因组百科全书(KEGG)数据库进行注释,并进行差异代谢物的KEGG通路富集分析。利用人类代谢组数据库(HMDB)对显著差异代谢物进行注释,找出其所关联的疾病信息。

2 结果

2.1一般资料 研究共纳入心火脾虚型AD患者20例,其中男6例,女14例,平均年龄(15.65±12.11)岁;健康志愿者20例,其中男6例,女14例,平均年龄为(15.55±12.12)岁。两组性别、年龄组成差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2代谢产物筛选结果 通过非靶向代谢组学定性检测来扩充粪便标本代谢产物检出种类,共检测到代谢产物553个。而对混样标本进行广泛靶向代谢组学的定性定量检测,共检测到代谢产物807个。4个质控样本(QC)的总离子流图如图1所示,可见代谢物检测总离子流的曲线重叠性高,即保留时间和峰强度均一致,表明质谱对同一样品不同时间检测时,信号稳定性较好。证明检测仪器具有较高稳定性,分析数据结果可靠,具有可重复性。

In positive total ion current environment; Under negative total ion current environment图1 QC样品质谱检测总离子流图叠加图Fig.1 The superposition diagram of total ion flow diagram detected by mass spectrometry of QC sample

通过对粪便样本检测到的代谢产物进行PCA(图2a),然后再基于有监督模式识别的多元统计分析方法,绘制OPLS-DA得分图(图2b),由图中可见AD心火脾虚组和健康对照组组间分离趋势明显,代表两组间代谢产物差异明显。对OPLS-DA模型进行置换检验(permutation test)[16],由图3中可见,本模型拟合度可,具有较好的预测能力,说明本OPLS-DA模型是有效,可以进行下一步的数据挖掘分析。

PCA; OPLS-DA score diagrams图2 AD组和健康对照组粪便共代谢产物PCA和OPLS-DA评分图Fig.2 PCA and OPLS-DA score diagrams of fecal co-metabolites in AD group and control group

基于OPLS-DA分析结果筛选出AD心火脾虚组的显著差异代谢物,绘制火山图(图4)。总共筛选出两组显著差异代谢产物77个,其中在AD心火脾虚组粪便标本中表达显著上调的差异代谢产物有39个,表达上调最明显的前5个差异代谢产物分别为溶血磷脂酰胆碱 22:5(2n isomer2)[lysoPC 22:5(2n isomer2)]、溶血磷脂酰胆碱 22:5(2n isomer1)[lysoPC 22:5(2n isomer1)]、色胺(tryptamine)、吲哚乙醛(indoleacetaldehyde)、2-苯乙胺(phenethy-lamine);表达显著下调的差异代谢产物38个,表达下调最明显的前5个差异代谢产物分别为18β-甘草次酸(18β-glycyrrhetinic acid)、醛固酮(aldosterone)、4-羟视黄酸(4-hydroxyretinoic acid)、5-L-谷氨酰-L-丙氨酸[(5-L-glutamyl)-L-amino acid]、甘草酸(glycyrrhizinate)。

Note:Green spots represent significant downregulation of differentially expressed metabolites; red spots represent significant upregulation of differentially expressed metabolites; black spots represent metabolites detected, but there was no significant difference.图4 两组粪便样本之间的差异代谢物火山图Fig.4 Volcano plot of differential metabolites between the two groups of fecal samples

2.3功能富集和关联疾病分析 通过KEGG数据库对差异代谢物进行注释和通路富集分析(图5),可见胆汁分泌(bile secretion)这条通路富集相对显著。通过HMDB对显著差异代谢物进行注释和疾病信息关联,可见关联疾病主要为消化系统、泌尿系统和内分泌系统的相关疾病,其中关系最为密切的是消化系统疾病,以结直肠癌、嗜酸性食管炎、溃疡性结肠炎、克罗恩病为主。

Note:The larger the rich factor value was, the greater the enrichment degree of the pathway was; the closer P-value was to 0, the more significant the enrichment degree of the pathway was; the size of the point represents the number of metabolites enriched in the corresponding pathway.图5 两组粪便样品中差异代谢产物的KEGG通路富集图Fig.5 KEGG pathway enrichment map of differential co-metabolites in two groups of fecal samples

3 讨论

心火脾虚证型AD患者肠道菌群共代谢产物呈现出与健康志愿者不一样的代谢轮廓。溶血磷脂酰胆碱是高密度脂蛋白的一种,其可有效抑制嗜酸性粒细胞的形状变化和迁移[17]。这与抑制嗜酸性粒细胞效应物反应的能力受损有关。本研究心火脾虚证型AD患者的肠道菌群共代谢产物中,溶血磷脂酰胆碱类产物以上调为主,可能与AD患者肠道对该类物质吸收减少、排泄增多有关。18β-甘草次酸和甘草酸通过抑制促炎基因的表达、抑制炎性细胞因子的产生以及影响花生四烯酸转化为促炎性白三烯而显示出抗炎活性,对AD有较好的治疗作用[18],这两者在心火脾虚证型AD患者的肠道菌群共代谢产物中呈显著下调趋势,可能与AD患者发病或皮疹加重有关。因此,溶血磷脂酰胆碱类与甘草次酸类物质可能成为表征心火脾虚证型AD的主要代谢产物,仍有待进一步的实验验证。在共代谢产物注释的KEGG通路中,胆汁酸分泌通路注释的频数最高。胆汁酸是一类重要的信号分子,其对肠道菌群以及宿主的免疫和代谢具有重要影响[19]。目前已知,胆汁酸代谢与AD等多种特应性疾病密切相关[20]。

通过对显著差异代谢产物进行注释发现,心火脾虚证型AD与多种消化系统疾病明显相关。目前,AD与结直肠癌相关性仍存在较大争议, Chou等[21]通过对AD患者健康保险资料队列研究发现,在男性和女性以及所有年龄组中,AD和结直肠癌风险之间均存在显著的正相关。然而部分研究认为AD与结直肠癌的发病无明显相关,甚至认为AD可以降低结直肠癌的发生风险[22]。AD与嗜酸性食管炎也密切相关,在转录组学上,两者共享一组共同的疾病特异性转录,有共同的分子病因学基础[24]。在细胞分子水平上,两者发病均与上皮细胞间的紧密连接(TJs)破坏导致的表皮屏障功能障碍有关[24-25]。同时,越来越多学者认为AD是一种系统性炎症反应,其与溃疡性结肠炎、克罗恩病等多种炎症性肠病也关系密切[26-28]。AD和共病之间的关系可能是双向和多因素的[29]。

中医认为“肺主皮毛”“肺与大肠相表里”,肺的宣降平衡对皮肤与大肠的生理稳定有重要作用。基于中医“皮肤-肺-大肠”相关理论,推测皮肤与大肠之间同样存在紧密联系,这大大拓宽了中医的脏腑理论,对于进一步解释皮肤与大肠之间的生理病理变化具有重要的现实意义。从现代医学角度,皮肤与肠道是人体的两个最大的器官,其在生理和病理上互相联系,这就是现代医学“皮肠轴”的概念[30],而肠道微生物群是“皮肠轴”的主要调节者[31],皮肤疾病与大肠微生态紊乱密切相关。肠道微生态的稳定与宿主的健康息息相关。宿主和肠道微生物群在小分子代谢物和共代谢物的介导下,通过共生或失调环境相互影响[32]。目前,特应性皮炎发病机制尚不明确,粪便代谢组学技术为寻找AD潜在生物标记物提供了新的视角。广义上讲,肠道菌群及其共代谢产物的平衡,是人体“阴阳平衡”的一部分,心火脾虚证AD患者正是因为“阴阳失衡”,在临床上表现为皮肤疾患,在代谢组学上表现出菌群共代谢产物的差异。

本研究通过代谢组学技术,在海量的代谢产物中寻找挖掘心火脾虚证型AD患者肠道菌群差异共代谢产物,并进行通路注释和疾病关联分析,这将有助于挖掘潜在的中医药治疗靶点,指导临床新药开发,也为心火脾虚证型AD患者的临床诊断、治疗研究和共病研究提供理论基础。由于本研究的时间、经费有限,纳入病例较少,仅作一初步探索性研究。今后可加大样本,分组进行研究讨论。对于挖掘分析得到的显著差异代谢产物,后续仍有待进一步验证。