自体浓缩生长因子联合毫火针激活 Wnt/β-catenin信号促进小鼠毛发生长

何勤,任婷婷,罗青,徐栋花,陈朋,曹哲,王国颖,王振华

雄激素性脱发是一种表现为进行性脱发的慢性疾病,其特点是毛囊微型化,生长初期的毛囊减少,静止期毛囊的数量增加[1]。常用的非那雄胺被批准用于男性,而外用米诺地尔被批准用于男性和女性[2]。这两种药物需要长期使用,且并非每个人都有显著的疗效,可能还会出现某些副作用。因此有必要进一步研究治疗雄激素性脱发的新方法[2]。

浓缩生长因子(concentrated growth factor,CGF)是从自体血提取出来的富含血小板和多种生长因子的新型血液制品,经反复改变离心速度制备,通过激活血小板α颗粒,释放大量的生长因子,促进伤口愈合和组织再生[3]。近年来其应用于临床治疗脱发取得了一定的效果,其作用机制仍有待研究。毫火针是将针置于酒精灯火焰上烧红后快速刺入人体一定穴位和部位的方法,毫火针改良了传统火针针头粗的缺点,减少疼痛及减轻瘢痕形成。已有少量基础研究表明毫火针可通过激活β-catenin信号促进动物的毛发生长[4]。临床上通过比较CGF联合毫火针治疗组和单一CGF治疗对照组治疗前后雄激素性脱发患者的临床照片、皮肤镜下的毛发检测指标和总有效率,得出CGF联合毫火针治疗雄激素性脱发对毛发的生长更有效,但未对CGF联合毫火针治疗雄激素性脱发的作用机制进行进一步探索研究。本研究通过建立雄激素性脱发小鼠动物模型,观察CGF联合毫火针治疗雄性小黑鼠(C57 black 6,C57BL/6)的治疗效果,探索其作用机制,为其临床应用提供科学依据。本研究经潍坊市人民医院医学科研伦理委员会批准(伦理编号:KYLL20210318-1)。

1 材料与方法

1.1动物 C57BL/6(雄性,6周龄)小鼠,18～22 g,购于山东省济南朋悦动物繁育有限公司,实验动物许可证号:SCXK(鲁)20190003。饲养于潍坊市人民医院中心实验室,所有小鼠在温度、湿度和光线适宜环境下适应性喂养1周后造模,实验期间小鼠自由进食、饮水和活动。

1.2主要试剂及仪器 BCA 蛋白定量试剂盒(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司);GAPDH、β-catenin 、GSK-3β一抗、HRP标记的山羊抗兔二抗(proteintech 公司);Wnt10b一抗(affinity公司);苏木精-伊红染液、睾酮、Mayer’苏木素染液、分化液G1862 、返蓝液G1866 、5X蛋白上样缓冲液 、柠檬酸钠抗原修复液(1X)(solarbio公司);5%米诺地尔(浙江万晟药业有限公司);兔二步法检测试剂盒(PV-9001)、DAB显色试剂盒(ZLI-9018)(北京中杉金桥生物技术有限公司);ECL化学发光底物(特超敏)、脱脂奶粉(bioshap公司);0.30 mm × 25 mm 毫火针(潍坊市人民医院皮肤科提供);蛋白垂直电泳仪及转膜仪(Bio-rad);普通光学显微镜(日本奥林巴斯公司);生物组织摊片烤片机(湖北伯纳医疗科技有限公司)。

1.3CGF的制备 采集人的静脉血24～36 mL,经KJLC-I Centrifuge变速离心机离心约12 min,离心结束后试管内血样分层:最下层为呈红色的红细胞层,中间层为呈橙黄色的CGF纤维蛋白层,最上层为淡黄色血清层,在无菌超净台中进行分离中间层,每8 mL静脉血保留中间层2 mL CGF。

1.4小鼠雄激素性脱发模型建立与实验分组 将36只C57BL/6雄性小鼠采用随机数法随机分为6组,每组6只,分别为模型组、空白组、米诺地尔组、CGF组、CGF+毫火针组、毫火针组。造模开始的前1 d,先用宠物剃毛器在小鼠背部以背脊线为中线,剃出一块2 cm×2 cm的区域,均匀涂上脱毛膏,3 min后用温水将脱毛膏洗去。自实验动物脱毛24 h后开始给药。具体给药方式如下:除空白组小鼠不给药,其余各组小鼠从脱毛后第1天起,每天在脱毛区域以10 mg/kg的剂量涂抹0.2%(W/V)睾酮乙醇溶液(其中睾酮溶于50%乙醇溶液),直至第28天,建立小鼠雄激素性脱发模型。并于脱毛后第1天起,CGF组于脱毛区域给予注射CGF 0.1 mL,每3 d注射1次,直至第28天。米诺地尔组每天在脱毛区域以250 mg/kg的剂量涂抹5%米诺地尔溶液,直至第28天。CGF+毫火针组在脱毛区域每3 d注射1次CGF加毫火针针刺1次,直至第28天。毫火针组在脱毛区域每3 d针刺1次,火针针刺点平均间距为1.5 mm, 深度至真皮浅层,直至第28天。

1.5肉眼评估 实验过程中密切观察实验动物背部皮肤颜色变化及毛发生长情况,并于第7、14、21、28天进行拍照记录,对比不同治疗组的作用效果。

1.6苏木精-伊红染色 首先制作皮肤石蜡切片,于给药第28天后,将各组小鼠处死,使用脱毛膏脱毛,用无菌组织剪剪取各组小鼠脱毛区皮肤组织。将皮肤组织用生理盐水漂洗2次后,置于装有4%多聚甲醛的离心管里,固定24 h以上。经脱水、透明、透蜡、浸蜡包埋、切片、烤片、脱蜡复水等一系列操作后,进行HE染色。苏木素染液染色2 min。自来水冲洗2 min。返蓝3 s,自来水冲洗2 min,蒸馏水2 min,伊红3 min,经梯度乙醇脱水,二甲苯透明,中性树脂封片。观察比较毛囊数量及分辨毛囊。

1.7免疫组织化学 组织切片制作参考苏木精-伊红染色。然后经烤片,脱水和水化,抗原修复,滴加一抗β-catenin (1∶2 000)、GSK-3β(1∶200)、Wnt10b(1∶200),滴加二抗,DAB显色,苏木素复染,脱水,透明,中性树胶封片后,光学显微镜下进行结果判读。阴性对照用 PBS 代替一抗,其余操作同前。切片在显微镜下随机选取小鼠皮肤组织不重复的6个视野拍照。使用Image J 图像软件对采集的图像进行一系列分析,得到反映目标物质的单位面积浓度的平均光密度值(average optical density, AOD),并对各组AOD值进行分析比较。

1.8Western blot检测 以上6组实验小鼠皮肤组织取材,收集总蛋白,进行 10% SDS-PAGE 电泳(80 V, 30 min; 120 V, 60 min),湿转法转到 PVDF 膜(200 mA),5% 脱脂奶粉封闭 2 h,一抗 β-catenin(1∶ 10 000)、GSK-3β(1∶1 000)、Wnt10b(1∶1 500),4 ℃ 孵育过夜,次日 TBST 洗 10 min × 3次,辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG( 1∶ 10 000)室温孵育 1 h。TBST 洗 10 min × 3 次,BIO-RAD曝光仪上曝光。

2 结果

2.1实验动物大体情况观察 造模28 d后,模型组小鼠背部皮肤仍呈粉红色,未见新生毛发长出,HE染色结果显示,该组毛囊数量少,毳毛比重大,毛母质萎缩,毛乳头缩小。上述结果说明,睾酮诱导的雄激素性脱发小鼠模型基本成功。各组小鼠给予28 d不同的治疗后,空白组毛发生长浓密,乌黑光泽;模型组背部无新生毛发长出;其余各组背部皮肤治疗区覆盖率尚可,毛发生长致密,且CGF+毫火针组及米诺地尔组小鼠毛发生长致密程度优于CGF组和毫火针组,表明4种治疗方法均能促进毛发生长,且CGF+毫火针组联合应用优于CGF组和毫火针组治疗(图1)。

图1 各组小鼠毛发生长情况Fig.1 Hair growth of mice in each group

2.2各组小鼠背部皮肤HE染色 在视野范围内,模型组毛囊数量最少;空白组、米诺地尔阳性对照组、CGF+毫火针组毛囊数量明显增多,密度大;火针组及CGF组次之。各治疗组及空白组毛囊以终毛为主,毛乳头体积增大,毛母质增多,上方出现较多黑色素颗粒。模型组以毳毛为主,毛干色素浅或无,直径小于内毛根鞘。说明本实验中使用的4种治疗方法均能增加小鼠毛囊尤其是终毛毛囊的数量,促进毛发生长,且CGF+毫火针组联合应用优于单用CGF或单用毫火针治疗效果(图2)。

Minoxidil group; CGF group; CGF + fire needling group; Fire needling group; Model group; Blank group图2 治疗后各组小鼠背部脱毛区皮肤组织病理 (HE×100)Fig.2 Histology of the skin of the dorsal depilated area of mice in each group after treatment (HE×100)

2.3各组小鼠的免疫组织化学结果 β-catenin、GSK-3β、Wnt10b阳性表达呈现棕黄色或棕褐色颗粒。米诺地尔组、CGF+毫火针组、空白组小鼠皮肤毛囊组织中Wnt10b阳性表达高于模型组,差异均有统计学意义(P<0.05);CGF+毫火针组小鼠皮肤毛囊组织中Wnt10b阳性表达高于CGF组和毫火针组,差异有统计学意义(P<0.001);米诺地尔组小鼠皮肤毛囊组织中Wnt10b阳性表达高于CGF组和毫火针组,差异有统计学意义(P<0.001)。米诺地尔组、CGF组及CGF+毫火针组小鼠皮肤毛囊组织中β-catenin阳性表达高于模型组,差异均有统计学意义(P<0.001);CGF+毫火针组小鼠皮肤毛囊组织中β-catenin阳性表达高于CGF组、毫火针组、空白组,差异均有统计学意义(P<0.001);米诺地尔组小鼠皮肤毛囊组织中β-catenin阳性表达高于CGF组、毫火针组、空白组,差异均有统计学意义(P<0.001)。毫火针组、模型组小鼠皮肤毛囊组织中GSK-3β阳性表达高于CGF+毫火针组,差异有统计学意义(P<0.01);空白组小鼠皮肤毛囊组织中GSK-3β阳性表达高于CGF+毫火针组,差异有统计学意义(P<0.001)。米诺地尔组小鼠皮肤毛囊组织中GSK-3β阳性表达低于模型组,差异有统计学意义(P<0.05)。表明CGF+毫火针组可能通过Wnt/β-catenin通路刺激毛发生长(图3～5,表1)。

表1 各组小鼠背部脱毛区皮肤组织中Wnt10b、β-catenin、GSK-3β平均光密度值对比Tab.1 Comparison of average optical density values of Wnt10b, β-catenin and GSK-3β in skin tissues of dorsal hair removal areas of mice in each

Minoxidil group; CGF group; CGF+fire needling group; Fire needling group; Model group; Blank group图3 各组小鼠的毛囊组织中Wnt10b的表达情况 (×200)Fig.3 Expression of Wnt10b in the hair follicle tissue of each group of mice (×200)

Minoxidil group; CGF group; CGF+fire needling group; Fire needling group; Model group; Blank group图4 各组小鼠的毛囊组织中β-catenin的表达情况 (×200)Fig.4 Expression of β-catenin in the hair follicle tissue of each group of mice (×200)

Minoxidil group; CGF group; CGF + fire needling group; Fire needling group; Model group; Blank group图5 各组小鼠的毛囊组织中GSK-3β的表达情况 (×200)Fig.5 Expression of GSK-3β in the hair follicle tissue of each group of mice (×200)

2.4CGF联合毫火针激活 Wnt /β-catenin 信号通路 用各处理方法(CGF联合毫火针组、毫火针组、CGF组、米诺地尔组、空白组与模型组)得出的Wnt10b蛋白表达含量不同,且差异有统计学意义(F=8.795,P=0.001 1)。在之后的两两比较中,Wnt10b蛋白表达在米诺地尔组、CGF+毫火针组、毫火针组高于模型组,差异均有统计学意义(P<0.05)。β-catenin蛋白表达在米诺地尔组、CGF组、CGF+毫火针组、空白组高于模型组,差异均有统计学意义(P<0.05),β-catenin蛋白表达在CGF+毫火针组高于毫火针组,差异有统计学意义(P<0.05)。GSK-3β蛋白表达在米诺地尔组低于模型组,差异有统计学意义(P<0.05);GSK-3β蛋白表达在CGF+毫火针组低于模型组,差异有统计学意义(P<0.01)。GSK-3β蛋白表达在CGF+毫火针组低于CGF组和毫火针组,差异均有统计学意义(P<0.05)。以上结果提示,CGF+毫火针可能通过激活 Wnt /β-catenin 信号通路促进毛发生长,毫火针能增强CGF促进相关蛋白的表达,改善毛发生长问题(图6)。

Note:1 indicated minoxidil group; 2 indicated CGF group; 3 indicated CGF+fire needling group; 4 indicated fire needling group; 5 indicated model group; 6 indicated blank group; compared with the model group, *P<0.05;**P<0.01,***P<0.001; compared with CGF+ fire needling group,#P<0.05.Western blot; Expression of Wnt10b protein; Expression of β-catenin protein;Expression of GSK-3β protein图6 各组小鼠毛囊组织中Wnt10b、GSK-3β、β-catenin蛋白表达情况Fig.6 Expression of Wnt10b, GSK-3β and β-catenin proteins in hair follicle tissues of mice in each group

3 讨论

雄激素性脱发是一种由双氢睾酮(DHT)介导的脱发疾病。双氢睾酮诱导毛囊小型化,导致终毛转化为毳毛,其作用机制可能与DHT和毛囊上的雄激素受体之间的相互作用抑制了典型的Wnt/β-catenin通路有关[5]。在小鼠模型中,DHT还显示通过阻断生长因子如胰岛素样生长因子1 (IGF-1)的作用来抑制毛发生长[6]。目前米诺地尔和非那雄胺是美国食品药品监督管理局(FDA)唯一批准治疗脱发的药物[7]。但因其副作用以及部分人不敏感等原因,需要更方便、副作用更小、疗效更佳的治疗方式。CGF是由Sacco 于2006年首次开发并在临床应用,是利用特制的变速离心机,依靠物理性加速度和减速度充分激活血小板中的α颗粒,产生富含更高浓度生长因子和CD34+细胞的自体血液浓缩制品[8-9]。为了分离提取静脉血中的细胞,CGF技术采用的速度从2 400～2 700 r/min不等。不同的离心速度分离出更大、更致密和更丰富的生长因子纤维蛋白基质。经离心后会产生三个成分:最上层为不含纤维蛋白原和凝血因子的血浆,即贫血小板血浆(platelet-poor plasma, PPP);中间层包含CGF、白细胞和非常大且致密的聚合纤维蛋白;底层为红细胞层。将PPP层和纤维蛋白块的交界面抽吸即可制成CGF[9]。制备过程中无需加入任何物质。CGF作为第三代血小板浓缩产品,对组织的修复和再生表现出良好的促进作用, 包括皮肤光老化、软组织缺损修复、隆鼻、脱发、自体脂肪移植和瘢痕,到目前为止还没有明显的不良反应报道[10]。其含有的多种生长因子能够促进血管形成,提供氧气和营养物质,以及可能通过作用于Wnt/β-catenin通路,促进毛发的生长。毫火针属于经典的中医外治疗法,兼具毫针与火针的优势,其直径更细,为0.2～0.3 mm之间,借火之力,穿透力更强,疼痛感轻,创口小,操作简单,近年毫火针治疗疾病的临床应用日益增多,如治疗带状疱疹后遗神经痛、膝关节骨性关节炎、周围性面神经麻痹等[11],研究表明毫火针联合用药效果优于单一治疗[4, 12]。

7周龄的C57BL/6雄性小鼠毛囊进入静止期,受到外界刺激后进入生长期,成为研究毛发生长最常用的动物模型[13-14],故本实验以之为研究对象,观察CGF联合毫火针对毛发生长的影响。结果显示,模型组无新生毛发长出,CGF+毫火针组及米诺地尔组、CGF组和毫火针组小鼠均有毛发长出,但CGF+毫火针组及米诺地尔组毛发生长更茂密,更乌黑发亮,说明CGF+毫火针组联合应用效果优于单一治疗。HE染色结果显示CGF+毫火针组以终毛为主,毛乳头体积增大,毛母质增多,出现较多黑色素颗粒,其总毛囊数比毫火针组及CGF组更多,而模型组以毳毛为主,毛囊数量少。免疫组织化学结果示β-catenin主要表达于表皮、外毛根鞘、毛球部和毛母质,CGF+毫火针组阳性表达高于CGF组、毫火针组、模型组;Wnt10b主要表达于外毛根鞘、内毛根鞘、毛母质,CGF+毫火针组阳性表达高于CGF组、毫火针组、模型组;GSK-3β主要表达于在毛发基质区,CGF+毫火针组阳性表达低于模型组及毫火针组。表明CGF+毫火针组可能通过Wnt/β-catenin通路刺激毛发生长。Western blot结果表明CGF+毫火针组的Wnt10b蛋白表达高于模型组;β-catenin蛋白表达在CGF+毫火针组高于毫火针组及模型组;GSK-3β蛋白表达在CGF+毫火针组低于模型组,CGF+毫火针组低于CGF组及毫火针组。说明CGF+毫火针组可能通过Wnt/β-catenin通路促进毛发生长,其相关蛋白表达量优于CGF组及毫火针组,可能是CGF+毫火针毛囊数量更多,毛发质量更好的原因。也表明毫火针能增强CGF在治疗雄激素性脱发的作用。

综上,本研究初步探索了CGF联合毫火针对C57BL/6小鼠毛发生长的影响及作用机制,为最终阐明CGF联合毫火针的临床治疗提供了理论基础。