中医心病湿证证候客观化的研究现状

蔡 静,曾巧煌,欧晓敏,江 巍,3,吕渭辉,3,蓝涛华,3

辨证论治在诊断、治疗心血管疾病,改善生活质量,维持心功能,降低再住院率方面有一定的优势。中医证候客观化是中医药现代化研究进程中遇到的问题,将病证结合动物模型应用于中医药研究,从形态、功能等多方面阐述中医药治疗的效果与原理,揭示中医证候的本质。因此建立一套既符合中医辨证理论,又具有稳定性、针对性及客观性的病证结合动物模型的评价体系,以期为中医心病湿证动物模型的构建及中医心病湿证研究提供思路,最终达到为临床服务的目的。 为深入探讨中医药在心血管疾病领域的作用机制,病证结合动物模型的构建及客观化评价是前提,建立及评价中医心病湿证证候客观化是研究关键。总结归纳中医心病湿证的微观诊断指标、证候定量诊断、与他证的鉴别诊断等,探索心病湿证候的本质及稳定可靠的生物模型,可为中医药客观化现代化研究提供依据。综述冠心病、高血压、心力衰竭3个心血管常见疾病探讨中医心病湿证的客观化进展。

1 中医心系疾病与湿邪

心系疾病病因病机复杂,历代医家对心系疾病病因病机及治疗进行了探索。古代医家早已意识到湿邪在心系疾病中的重要作用,《金匮要略·胸痹心痛短气病脉证治》中指出胸痹心痛的病机为“阳微阴弦”,阳微为本,为胸阳不足,阴弦为标,指阴寒痰湿偏盛。《温病条辨》中提到胸痹心痛的病机为“肺水克心”,“肺水”指外来湿邪,“克心”指克制心火,即病机为外湿抑制胸阳,胸阳不振发为胸痹心痛。《济生方·惊悸怔忡健忘门》中亦有“风寒冷湿闭塞诸经,令人怔忡”的记载。现代发现,六淫之湿具有病因、病理的双重意义,湿邪作为致病物质或致病条件,是物质性、条件性与某些人体反应性的综合概念,六淫致病的临床表现包含了体质、病种、致病因素等的综合作用[1]。

从湿论治、从脾论治心系疾病的方式方法及相关中药方剂疗效显著。《金匮要略·胸痹心痛短气病脉证治》中记载了通阳化湿代表方剂栝蒌薤白半夏汤、枳实薤白桂枝汤、茯苓杏仁甘草汤;调脾胃以化湿代表方剂橘皮枳实生姜汤、人参汤及温肾化湿的薏苡附子散等。《太平惠民和剂局方》记载二陈汤通过化湿理脾治疗痰湿所致的心悸。王守富等[2]从痰湿论治冠心病心绞痛,结果显示,六君子汤或参苓白术散加减、逍遥散合半夏厚朴汤加减、理中丸合二陈汤、参附汤、冠心Ⅱ号合瓜蒌薤白半夏汤或《寿世保元双合汤》加减、小陷胸汤合温胆汤加减等补气、行气、温阳、活血、清热化痰之法。由此可见,在心系疾病病因病机及治疗方式的探索中,湿邪致病、从湿论治及湿证证候客观化是中医心系疾病研究的关键。

2 中医心系疾病湿证证候客观化的研究现状

证候是中医治疗的核心,准确辨出湿证是“对证下药”的前提,“异病同治”关键在于对证的准确把握。中医理论的辨证具有多样性,证与证之间既交叉又独立,准确评价湿证尤为重要。

2.1 湿证的生物学模型及客观指标 系统生物学的不断发展为中医病证结合研究带来了新思路和技术手段,中医传统理论结合现代医学研究方法从组织、分子、免疫等方面探讨中医心病湿证的客观化发展。其中生物学模型的构建与科学评价、生物标志物研究尤其重要,且因临床上湿证辨证多样,湿证动物模型的造模方法复杂,现模拟临床病因病机建立的湿证病证结合动物模型进行分析、归纳和总结。

2.1.1 单因素造模 李蓉[3]将昆明小鼠置于人工气候箱中饲养,其余时间按常规室温饲养,连续观察7 d;模型组小鼠出现体重下降、肠道菌群失调、小肠炎性反应、组织结构紊乱、水液代谢障碍、免疫系统紊乱等多方面改变,符合外感寒湿致病的病理表现。章敏[4]将Wistar大鼠置于人工气候箱中饲养,每日刺激8 h,持续观察30 d;观察到肠道菌群数量随着湿度升高而增加,如金黄色葡萄球菌、链球菌、军团杆菌、大肠杆菌及真菌数量;同时,具有致病性的大肠杆菌数量增加,对机体有益的双歧杆菌减少;出现机体免疫功能紊乱、胃肠激素失调、胃泌素减少,大鼠肾脏水通道蛋白2(AQP2)mRNA减少的情况。

2.1.2 复合因素造模 将复合因素造模法模拟临床湿证病因病机的动物模型进行分析、归纳和总结。

2.1.2.1 湿热证生物模型的评价指标 程方平等[5]采用新西兰兔和Wistar大鼠造模,人工气候箱模拟外湿,每次灌服54 °白酒5 mL+油脂10 mL/(2 kg·d)模拟内湿,灌服大肠杆菌模拟客邪,造湿温病模型;可见高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)增高。谭永振[6]采用SD大鼠构造湿偏重组与热偏重组模型,可见大鼠尿液中AQP2、p物质(SP)70升高,胃窦匀浆胃窦SP及生长抑素(SS)含量降低,同时胃、十二指肠病理切片显示,胃黏膜层有大量中性粒细胞、嗜酸性粒细胞浸润,血管扩张充血,胃黏膜下层可见组织水肿,中性粒细胞、嗜酸性粒细胞浸润明显,十二指肠可见绒毛上皮细胞脱落、大量炎性细胞渗出。有研究使用人工气候箱建立正常、湿和湿热3种不同温度和湿度的环境,结果显示,饲养在湿热环境中的小鼠接触流感病毒时表现出免疫耐受性,身体无法有效清除病毒,导致持续感染,说明温暖、潮湿的环境可能干扰了免疫反应和平衡[7]。有研究显示,高湿、高温环境导致体内炎性细胞因子表达升高,造成Th17/Treg免疫失衡,抑制Treg成熟和分化,增加白细胞介素(IL)-2、IL-6等细胞因子表达,降低γ干扰素(IFN-γ)和IL-17A表达[8]。王婷等[9]将BALB/c小鼠置于人工气候箱中模拟湿热环境,灌胃致脾虚;腹腔注射脂多糖(LPS)工作液完成湿热模型造模,结果显示,INF-γ、肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平均出现升高;湿热模型肠道菌群含量出现不同程度增加;以脾阳虚为内湿基础的湿热证,双歧杆菌属、乳杆菌属含量减少,湿邪困扰为内湿基础的湿热证双歧杆菌属、乳杆菌属含量增多。

2.1.2.2 脾虚湿困生物模型的评价指标 朱寿光[10]强迫SD大鼠游泳15 min后灌胃液态猪油,灌蜂蜜模拟内湿模型;胃泌素水平和胃壁黏液量下降,胃肠推进运动明显减弱,小肠推进出现断续现象,全血5-羟色胺(5-HT)、5-羟吲哚醋酸(5-HIAA)含量及血清Na+-K+-三磷酸腺苷(ATP)酶降低。赵丽等[11]单日施加猪油脂,双日上午在跑步机上跑步约30 min,以汗出喘息为止,下午喂饲甘蓝进行造模;结果显示,丙二醛和CD指标升高,过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)下降,上述物质可能作为客观评价指标。刘伟[12]将SD大鼠置于人工气候箱中模拟外湿条件,给予单日禁食联合4 ℃冰水灌胃,双日给予充足饲料并给予猪油灌胃+4 cm水深,控制睡眠8 h造湿证模型;结果显示,脾虚湿困大鼠脏器系数增加,血清电解质水平紊乱,代谢异常,胰岛素水平下降;脾脏及胸腺脏器系数降低,胸腺皮质厚度及脾脏中央动脉淋巴鞘直径、面积变小,血清IL-6升高,IgG含量减少;运用反证药物平胃散治疗该模型说明大鼠脾虚湿困造模成功。有研究显示,利用8周的时间建立60只高脂饮食和力竭游泳的脾虚水湿证Wistar大鼠模型,贡献基因主要集中在Fabp、SLC和AQP家族,即蛋白质和多糖的组成对脾虚水湿证模型大鼠水液转运的调节作用显著[13]。

2.1.3 湿证证候组学研究 系统生物学的研究方法与中医整体概念的理论内涵相似,为中医和现代医学提供了重要方法。通过代谢、蛋白、基因、转录等方面,探讨证候的生物学基础,为证候的可分离性提供了生物学依据。将SD大鼠置于人工气候箱模拟的高温高湿环境中,除正常饮食外,湿阻证大鼠每日给予蜂蜜、猪油;采用湿阻证大鼠脏器组织等蛋白的半定量实时荧光聚合酶链式反应(RT-PCR)测定热休克蛋白,说明高温高湿环境为湿热证而非暑湿证;同时结果显示,湿证大鼠肾、脾、胃组织中ATP储存量减少,提示氧化应激、膜完整性、黑色素生物合成、离子通道活性和ATP代谢可能是湿证的标志[14-15]。临床研究显示,严格按照《治疗血脂异常的中药新药临床研究指导原则》筛选脾肾阳虚证与痰湿阻滞证病人,比较临床指标总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、HDL-C,并与健康对照组相比,脾肾阳虚血脂异常病人和痰湿阻滞证血脂异常病人,差异有统计学意义;脾肾阳虚血脂异常病人、痰湿阻滞证血脂异常病人与健康对照组、痰湿阻滞证与脾肾阳虚血脂异常病人氨基酸代谢、脂代谢、碳水化合物代谢比较,差异有统计学意义;与脾肾阳虚病人相比,痰湿阻滞病人血脂异常代谢途径不同:①丙酮酸代谢途径;②甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢途径;③谷氨酰胺和谷氨酸代谢途径;④丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢途径;⑤TG代谢途径[13]。

2.2 湿证复合素造模情况(见表1)

表1 湿证复合素造模情况

3 中医心系疾病湿证证候的研究现状

病的概念反映了某一种疾病全过程的总体属性、特征和规律;证是疾病过程中某一阶段的病理概括,包括病变的部位、原因、性质、正邪关系,因而证较症状可全面、深刻、准确地揭示疾病的本质。病与证均能反映疾病的本质,病证结合的内涵既体现在中医现代化的进程。现代医学的飞速发展使人们对疾病微观探索掌握更加明确,病证结合将促进中西医结合。中医心系疾病湿证证候客观化现状见表2。

表2 中医心系疾病湿证证候客观化现状

3.1 冠心病 有研究显示,冠心病在不同地区病性要素占比不同,南方、北方、西北地区频数居前3位的病性要素为血瘀、气虚、痰浊,且近20年冠心病的常见证候依次为血瘀、气虚、痰浊,与现代临床对冠心病“本虚标实”的认知[17]基本一致。冠心病湿证客观化临床研究主要从“辨证”即诊断客观化与“论治”即疗效评价客观化着手。

3.1.1 冠心病湿证客观化的临床研究 曲淼[18]研究显示,气滞痰阻证多在冠心病发作期,在冠心病痰阻心脉证临床诊断方面除四诊合参外,一些实验检测指标如RDW、HDL-C水平降低,hs-CRP、TC、TG、LDL-C水平升高可作为冠心病中医辨证的客观参考[19]。杨一格[20]从冠心病痰证病人AGEs出发,发现病人血清AGEs及AGEs受体(RAGE)水平增加,相关基因RAGE mRNA和Fox1 mRNA表达水平更高;冠心病痰浊内阻证病人从湿辨治发现,治疗组心绞痛症状、中医证候疗效、心电图疗效及血液流变学改善的总有效率高于对照组。朱璞玉等[21]研究发现,冠心病痰证病人转化生长因子-β1(TGF-β1)-磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)-糖胺聚糖(GAG)通路可能是痰病变的特征信息,其中TGF-β1与生痰因子相关,而GAG和蛋白聚糖(versican)可能为“痰”的物质基础。何浩强[22]研究显示,冠心病稳定型心绞痛痰瘀互结证病人存在代谢组学差异表达,其通路与生物功能和氨基酸代谢、甘油磷脂代谢和类固醇激素生物合成相关;多组学联合研究发现趋化因子8(CXCL8)、CCL2、集落刺激因子-1(CSF1)、Serpin家族D成员1(SERPIND1)可作为生物标志物,提示免疫反应是冠心病稳定型心绞痛痰瘀互结证发生发展的生物学基础之一。朱明丹等[23-24]通过血浆代谢组学发现,冠心病痰浊阻滞证与能量代谢、脂质代谢、糖代谢、氨基酸代谢紊乱密切相关,其生物标志物可能是葡萄糖、花生四烯酸、亚油酸等代谢产物。张红栓[25]研究冠心病痰浊证与血瘀证的区别,其中痰浊证病人尿液中柠檬酸、α-酮戊二酸、顺式-乌头酸等含量较高,胆汁酸、组氨酸含量较低。张秀梅[26]对比痰湿瘀阻型及非痰湿瘀阻型冠心病病人血管紧张素转换酶(ACE)基因多态性分布,结果显示,痰湿瘀阻型DD基因型及D等位基因分布频率高,可能是冠心病中医辨证分型的基础物质。

3.1.2 冠心病湿证客观化的基础研究 高杉等[27-29]分别对Wistar雄性大鼠及载脂蛋白E基因敲除(ApoE-/-)小鼠建立冠心病痰瘀互结证模型并进行评价,采用高脂饲料联合结扎冠状动脉左前降支建立模型;使用心肌酶指标、血流变指标、血小板聚集指标评价模型;将模型用于发病机制的探讨,结果显示,大鼠心肌细胞蛋白激酶B(Akt)、磷酸化Akt(p-Akt)和Bcl-2蛋白下调,促凋亡蛋白Bax和Caspase-3蛋白上调,激活PI3K/Akt通路,促进细胞凋亡。继高脂喂养小型猪结合冠状动脉球囊损伤左冠状动脉前降支建立病证结合模型研究之后,有研究进行了方证分析,比较方证不相应的生脉胶囊,与痰瘀互结证对证的丹蒌片,结果显示,丹蒌片可降低血脂代谢,缩小心肌梗死面积,降低主症和兼症评分等[30]。除对生物标志物分析外,方证相应可能对证候客观化诊断、模型评价亦有一定的说服力。

3.2 心力衰竭湿证诊断的客观化 Zhou等[31]收集了208例心力衰竭住院病人的临床资料,总结中医证候特点,结果显示,痰浊证LVEF检出率为50%,水湿阻滞组NT-proBNP较高。从证型分布与心功能分级方面分析,Miao等[32]分析134例慢性心力衰竭病人,结果显示,中医证型以气虚血瘀型、痰瘀交织型、气阴虚型、内湿热滞型和阳虚型为主,证型分布与纽约心脏病协会(NYHA)心功能分级有关。Shi等[33]通过回顾分析1 036例病人,将慢性心力衰竭的证与NYHA心功能分级联系起来,进一步发现与Ⅰ级、Ⅱ级病人相比,Ⅲ级、Ⅳ级病人阳虚、水湿发生率较高,痰浊发生率较低。Li等[34]回顾性分析1 451例慢性心力衰竭病人,结果显示,男性病人以痰阻心脉气虚血瘀证多见,女性病人多见心血瘀阻气阴虚证。姜坤[35]收集并整理冠心病合并心力衰竭4个临床阶段的中医四诊信息和实验室指标,结果显示,心力衰竭湿阻气结证与室壁瘤呈正相关,与窦性心动过速、白细胞降低、心室容量升高、平板运动耗氧量>20 mL/(min·kg)、实际碳酸氢根<21.3呈负相关[5]。

3.3 高血压

3.3.1 高血压湿证客观化的临床研究 有研究显示,高血压中医辨证分型与动脉血流动力学有关,痰湿内阻病人动脉血流动力减慢;痰湿内阻大脑中动脉、大脑前动脉血管脉搏指数高于其他证型[36]。薛文静[37]研究显示,原发性高血压痰湿壅盛证病变程度与ROCKⅡ、NF-κB p65和ROCKⅡ mRNA呈正相关,且与ROCKⅡ密切相关。葛明立[38]研究显示,载脂蛋白ε4等位基因可能与痰湿壅盛证具有一定的相关性。Zhang等[39]综合了痰湿综合征高血压病人体重变化整合蛋白质组学和代谢组学分析,公认的生物标志物磷脂酰胆碱(PC)、补体C3、C4a/C4b、α-2-巨球蛋白(A2M)和抗凝血酶(SERPINF1)是病人体重变化的强有力预测因子。吴天敏等[40]通过比较原发性高血压痰湿壅盛型的相关指标,可见乳酸、丝氨酸、葡萄糖、蛋氨酸、丙氨酸含量减少,氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)、LDL-C、丙酮含量增多。李小兵等[41]临床研究发现,血清sICAM1、sVCAM1在痰湿证病人中特异性升高,二者可作为原发性高血压痰湿证辨证的客观指标之一。

3.3.2 高血压湿证客观化的基础研究 吴赛等[42]使用Wistar大鼠高脂饮食建立痰湿壅盛型高血压模型,可见痩素可作为评价痰湿壅盛证高血压大鼠模型的客观指标之一;肾素-血管紧张素系统(RAS)的激活和高瘦素血症在痰湿壅盛型高血压发展过程中发挥着关键作用,NF-κB上调提示着机体的炎症状态联合构成了本证型的分子基础;本证型的病理机制可能与JAK2/STAT3通路、PI3K/Akt通路及NF-κB通路活化密切相关。姜凌宇等[43]采用相同的大鼠造模方法予以半夏白术天麻汤“以方测证”,结果证实,半夏白术天麻汤不仅可改善痰湿壅盛型高血压的临床症状,同时可降低血压、血脂及改善胰岛素抵抗等。姜月华等[44]利用高脂饲料喂养C57BL/6Cnc小鼠25周,以体质量、血压均大于等于对照组平均值25%作为判定“痰湿壅盛型高血压小鼠模型”成功的标准,经超高效液相色谱-质谱联用(UPLC-MS)分析血浆代谢组变化,得出磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰胆碱、L-异亮氨酸、乙酰肉碱可作为痰湿壅盛型高血压小鼠模型的特征血浆代谢标志物;并通过京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析,差异代谢物主要富集于胆碱代谢、促性腺激素释放激素信号通路、氨基酸的合成、磷脂酶D信号途径等及产热、表皮生长因子受体(EGFR)信号通路、NF-κB信号通路等。

4 小结与展望

在中医证候方面,目前多模拟病因,恒温箱的使用模拟外湿、高脂饮食模拟内湿,结合多种力竭方式、禁食方式或药物、生物致病因子的干预模拟脾虚。在病证结合模型的评价上,由于中医心病湿证与病因、病理、免疫、生化、代谢等密切相关,如何将诸多因素有机结合确定其证至关重要。临床上证的发展是动态变化的,因此评价指标也是动态变化的。从动物模型的选择、造模时间、饮食饲料的配方、用量用法及湿证动物模型的评价指标依赖于科研、临床经验甚至是主观感受。如何将科研、临床经验整合,形成公认、稳定、可重复性高的湿证生物模型建模方法及公认、科学的湿证生物模型的评价体系是今后研究的方向。病证结合的客观化研究任重而道远,为解决这个问题提出以下建议:首先,进一步完善中医心病湿证的量化和诊断,建立统一、规范的诊断标准;其次,建立重复性好、公认的生物模型,找到特异度、灵敏度高的指标进行评价,同时不局限个别指标,从多个指标变化和相互关系以评价病证结合模型;最后,从中医整体观与病证结合的角度进行代谢组学、蛋白质组学等的系统生物学研究,对参与疾病发生过程的信息物质相互关系进行深入探讨,揭示中医心病湿证的本质。