应用响应面法优化副猪嗜血杆菌冻干保护剂

蔡国华,周明光,张 迪,戴昕燕,潘建刚,徐晓娟,何启盖,蔡旭旺*

(1.华中农业大学 动物医学院 农业微生物学国家重点实验室,湖北 武汉 430070;2.武汉科前生物有限公司,湖北 武汉 430200)

副猪嗜血杆菌(Haemophilusparasuis)定植于猪上呼吸道,可导致猪的多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎,对养猪业造成较大的经济损失[1-2]。近年来,伴随着“限抗令”的实施,副猪嗜血杆菌病的防控变得更加困难。弱毒活疫苗相比于灭活疫苗,不仅成本相对较低,而且可以刺激机体产生更加全面的免疫应答,在传染病防控方面发挥着重要作用[3]。

冷冻干燥作为一种物质保存技术,被广泛应用于活疫苗的制备。然而,冷冻干燥过程存在诸多损伤应力,均会导致细胞活性下降甚至死亡[4],因此,往往需要添加合适的保护成分来降低细胞活性损失[5]。相比于其他细菌,副猪嗜血杆菌十分脆弱,培养时生长缓慢且在外界存活时间短暂[6],因此该菌对冷冻干燥保存条件要求非常苛刻。本研究重点对副猪嗜血杆菌候选疫苗株HS1712的冻干保护剂进行优化,提高菌株在冷冻干燥条件的存活率,进而推动弱毒疫苗商品化生产。

1 材料与方法

1.1 菌株猪嗜血杆菌分离株HS1712,血清型7型,由本实验室分离鉴定并保存。

1.2 主要试剂及仪器胰蛋白胨大豆琼脂培养基(Tryptic soy agar,TSA)(批号:0147211)、胰蛋白胨大豆肉汤培养基(Tryptic soy broth,TSB)(批号:0079962)购自美国BectonDickinso公司;烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NAD)(批号:70080032)、海藻糖(批号:21211045,纯度≥98%)购自北京兰杰柯科技有限公司;新生牛血清(批号:20200725)购自内蒙古金源康生物工程有限公司;甘油(批号:20190815,分析纯)、甘露醇(批号:20200422,分析纯)购自国药集团化学试剂有限公司;脱脂奶粉(批号:EZ6789B128)、牛血清白蛋白(Albumin bovine,BSA)(批号:EZ6789D179)购自德国BioFroxx公司;L-抗坏血酸钠(批号:C12371584)购自上海麦克林生化科技有限公司;聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone,PVP)(批号:H08X025)购自于英国Alfa Aesar公司;Christ冻干机(型号:Epsilon 2-6D LSC plus)购自德国Marin Christ公司。

1.3 试验菌株复苏及扩培将-20℃冷冻保藏的冻干菌种用TSA培养基(添加体积分数为5%血清和质量浓度为10 mg/L NAD)复苏活化,置于37℃恒温箱培养48 h。挑取单菌落接种于5 mL TSB液体培养基(添加体积分数为5%血清和质量浓度为10 mg/L NAD),37℃,180 r/min,振荡培养7～9 h。以1∶1 000转接比例转接于TSB液体培养基扩大培养10～12 h。

1.4 冻干保护剂的制备本试验所涉及保护剂均使用超纯水溶解并配制不同比例,脱脂奶粉、PVP于110℃高温下灭菌30 min;海藻糖、L-抗坏血酸钠、甘露醇、甘油使用孔径0.22 μm的滤膜过滤除菌。

1.5 冷冻干燥过程将TSB液体培养至对数末期的菌液进行离心,5 000×g离心10 min。使用原菌液体积1/2的磷酸盐缓冲溶液(0.01 mol/L,pH=7.4)重悬菌体沉淀,后将菌液与冻干保护剂成品混合。充分混匀后,吸取2 mL混合液分装于无菌的7 mL 管制玻璃瓶,置于冻干机进行冻干。冻干结束后,制品于-20℃冰箱冷冻保存。

1.6 试验指标的测定以副猪嗜血杆菌冻干存活率作为指标来评估不同保护剂配方保护效果,其计算方法如下:

冻干前活菌计数:将菌液与冻干保护剂按照1∶1比例混合,充分涡旋后吸取0.1 mL混合液至0.9 mL TSB液体培养基(未添加NAD和新生牛血清)中进行10倍稀释,即为10-1稀释倍数。取100 μL 10-1稀释液加入第2个离心管进行10倍稀释,即为10-2稀释倍数,依此类推,倍比稀释至合适的稀释倍数10-n。取100 μL 10-n稀释液接种于TSA培养基,置于37℃恒温培养箱,静置培养24 h,进行计数。

冻干后活菌计数:在冻干制品中加入2 mL磷酸盐缓冲溶液,使其恢复至冻干前体积,静置3 min使其充分复水后进行活菌计数,计数方法参照冻干前。

1.7 配方成分组成优化以5.0%脱脂奶粉、1.5%甘油、4.0%海藻糖、2.0%甘露醇、1.0% BSA、1.0%L-抗坏血酸、0.5% PVP为基础配方,分别对配方中的甘油、海藻糖、甘露醇、BSA、L-抗坏血酸钠、PVP进行缺失来探究其对副猪嗜血杆菌HS1712冻干存活率的影响,由于配方中的脱脂奶粉具有填充作用,故不对此成分进行缺失(表1)。冷冻干燥具体过程按1.5方法进行,并按1.6方法测定、计算其冻干存活率。

表1 单因素缺失试验

1.8 配方成分添加比例优化

1.8.1单因素变量试验 脱脂奶粉对冻干存活率的影响:固定甘油的添加比例为1.5%,海藻糖的添加比例为4.0%,考察不同的脱脂奶粉添加比例3.0%,5.0%,7.0%,9.0%,11.0%对副猪嗜血杆菌HS1712冻干存活率的影响。冷冻干燥过程按1.5方法进行,并按1.6方法测定、计算其冻干存活率。

甘油对冻干存活率的影响:固定脱脂奶粉的添加比例为5.0%,海藻糖的添加比例为4.0%,考察不同的甘油添加比例0.5%,1.5%,2.5%,3.5%,4.5%对副猪嗜血杆菌HS1712冻干存活率的影响。冷冻干燥过程按1.5方法进行,并按1.6方法测定、计算其冻干存活率。

海藻糖对冻干存活率的影响:固定脱脂奶粉的添加比例为5.0%,甘油的添加比例为1.5%,考察不同的海藻糖添加比例0.5%,1.0%,2.0%,3.0%,4.0%对副猪嗜血杆菌冻干存活率的影响。冷冻干燥过程按1.5方法进行,并按1.6方法测定、计算其冻干存活率。

1.8.2Box-Behnken响应面法试验设计 基于单因素变量试验结果,以脱脂奶粉、甘油、海藻糖为自变量,副猪嗜血杆菌冻干存活率为响应值,应用Design-Expert 11软件设计了3因素3水平共17次的Box-Behnken响应面试验。其中中心点设置为5组重复试验,用以估计试验误差,Box-Behnken试验设计中各因素选取水平见表2。

表2 Box-Behnken试验中所选取因素的水平 %

2 结果

2.1 配方成分组成优化由图1可知,配方中甘油、海藻糖的缺失显著降低了副猪嗜血杆菌HS1712冻干存活率(P<0.05),缺失后菌株冻干存活率分别从55.14%降至37.83%,41.45%,说明甘油、海藻糖为不可缺少成分。甘露醇、BSA、L-抗坏血酸缺失后,菌株冻干存活率无显著变化(P>0.05),从经济角度和保护效果综合考虑,配方中不添加这3种成分;PVP的缺失对菌株冻干存活率无显著作用(P>0.05),但是PVP的添加可以改善冻干制品的形态,故将其作为添加成分。因此,最终配方为脱脂奶粉5.0%、甘油1.5%、海藻糖2.0%、PVP 0.5%。

2.2 配方成分添加比例优化

2.2.1单因素变量试验 由图2可知,副猪嗜血杆菌HS1712对不同添加比例的保护剂成分表现出明显的剂量依赖性。脱脂奶粉、甘油、海藻糖的最佳添加比例分别为5.0%,1.5%,2.0%,冻干存活率分别为64.20%,63.79%,74.44%;从经济成本和保护效果2个方面综合考虑,最终确定脱脂奶粉的最佳添加比例区间为3.0%～7.0%、甘油的最佳添加比例区间为0.5%～2.5%、海藻糖的最佳添加比例区间为1.0%～3.0%。

1.甘油缺失;2.海藻糖缺失;3.甘露醇缺失;4.BSA缺失;5.L-抗坏血酸钠缺失;6.PVP缺失;同组数据含相同字母表示差异性不显著(P>0.05),不同字母表示差异显著(P<0.05)。下同

图2 单因素变量试验结果

2.2.2Box-Behnken响应面法试验设计 采用Box-Behnken响应面法对副猪嗜血杆菌HS1712冻干保护剂成分的添加比例进行进一步优化。表3为响应面试验设计及其响应值。使用Design-Expert 11软件对表3试验结果进行模型拟合,拟合得到的回归方程为:Y=74.48+4.59×A+3.19×B+5.38×C-4.25×AB+2.47×AC+3.45×BC+0.60×A2-2.10×B2-7.70×C2,其中A、B、C 分别表示脱脂奶粉的添加比例、甘油的添加比例、海藻糖的添加比例,Y为副猪嗜血杆菌HS1712的冻干存活率。

表3 Box-Behnken设计表及其响应值

通过对回归方程进行方差分析可知(表4),该模型的P值=0.000 2<0.010 0,表明该模型呈现出极显著水平;失拟项P值=0.865 0>0.050 0,失拟项不显著,即试验数据与模型拟合度较好;模型决定系数R2=0.966 7,有96.67%的试验数据可以用该模型来解释,即表示相关性好。模型变异系数(CV)值为3.00%,说明模型的精确度和可信度较高;信噪比(adeq precision)为12.865 3,大于下限值4.000 0,说明模型的平均预测误差小,拟合度好。

在回归方程中,一次项P值均小于0.010 0,表明在试验范围内3个因素对副猪嗜血杆菌HS1712冻干存活均有极显著影响,交叉项中AB、BC的P值小于0.050 0,说明因素A和因素B、因素B和因素C之间的相互作用对副猪嗜血杆菌HS1712冻干存活影响显著;二次项中C2对副猪嗜血杆菌HS1712冻干存活有极显著影响。

表4 Box-Behnken试验的方差分析

应用Design Expert 11软件绘制不同考察因素对于副猪嗜血杆菌HS1712冻干存活率影响的3D响应面图,用来确定各因素的最佳范围以及评价各考察因素之间的相互作用。由图3结果显示,各3D响应面图峰开口均朝下,说明拟合的回归方程有最大值,脱脂奶粉、甘油、海藻糖的最佳添加比例区间分别是6.0%～7.0%,2.0%～2.5%,2.5%～3.0%。图3A和图3B响应面图坡度陡峭,且对应的等高线致密,说明脱脂奶粉与甘油、甘油与海藻糖之间交互作用对副猪嗜血杆菌HS1712冻干存活率影响显著,与表4方差分析结果一致。

通过解析回归方程,得出海藻糖、甘油、甘露醇的最佳添加比例分别为:脱脂奶粉6.8%、甘油2.2%、海藻糖2.7%,副猪嗜血杆菌HS1712冻干存活率预测值为80.87%。

2.2.3回归方程的验证 使用该配方:脱脂奶粉6.8%、甘油2.2%、海藻糖2.7%、PVP 0.5%进行冻干验证,副猪嗜血杆菌的冻干存活率分别为80.32%,78.40%,78.89%,平均冻干存活率为79.20%,与预测值相差1.67%,无显著性差异(P>0.05),说明该回归模型具有一定的使用价值。

3 讨论

在本研究中,基于冻干保护剂的性质组建了多种配方,通过冻干试验发现,以脱脂奶粉、海藻糖、甘油、PVP为主要成分组成的配方能够显著提高副猪嗜血杆菌HS1712对冻干环境的耐受能力,这可能是由于不同保护机制成分共同协同促进的结果。脱脂奶粉作为一种传统保护剂,其中的蛋白质成分可以在细胞表面形成一层具有黏性的膜层,防止冰晶对细胞造成损伤[7]。CHEN等[8]使用25%脱脂奶粉为基础的配方使得双歧杆菌在冷冻干燥后的存活率显著提高至90.37%。海藻糖作为一种非还原性二糖,在干燥阶段可通过氢键与脂质相互作用来维持酰基链之间正常的范德华力,使得细胞膜维持类似于水存在时的物理状态[9-10]。甘油作为小分子物质,可减缓低温以及冰晶对细胞所造成的损伤,从而降低了预冻阶段对细胞所造成的损伤[11]。而聚乙烯吡咯烷酮(PVP)的添加通过强化玻璃状基质来进一步提高蛋白质的稳定性[12]。

响应面法(response surface methodology,RSM)作为一种综合试验设计和数学建模的方法,多用于配方及工艺的优化[13-14]。本研究通过Box-Behnken响应面法对配方优化的过程中发现,脱脂奶粉、甘油、海藻糖的添加可显著影响副猪嗜血杆菌HS1712在冷冻干燥后的存活率,这与杨晓菲等[15]的结果相似,其也发现海藻糖为影响副猪嗜血杆菌冻干存活的显著成分。通过对Box-Behnken试验结果进行回归模型拟合,得到最佳添加比例为脱脂奶粉6.8%、甘油2.2%、海藻糖2.7%,具体配方成分及添加比例为脱脂奶粉6.8%、甘油2.2%、海藻糖2.7%、PVP 0.5%。使用优化后配方制得副猪嗜血杆菌冻干菌粉,理论冻干存活率为80.87%,试验验证其实际冻干存活率为79.20%,拟合模型与实际验证无显著差异性,证明了模型的可靠性。

另外,本研究还发现,BSA、甘露醇、L-抗坏血酸钠的添加并不能显著增强副猪嗜血杆菌HS1712在冷冻干燥后的存活率,其原因可能是:BSA作为大分子蛋白质类保护剂,由于其体积较大,通过空间位阻来抑制了海藻糖、甘油等小分子物质与细胞膜表面的相互作用[16-17];甘露醇作为一种结晶类物质,其在预冻阶段所形成的结晶会降低配方的玻璃态黏度,从而影响配方的保护效果[18-19]。L-抗坏血酸钠作为一种抗氧化剂,其作用可能重点体现在制品储存阶段,通过消耗冻干制品内部的氧或抑制氧化活性物的产生增加冻干制品的储存稳定性,而对冷冻干燥过程影响较小[20]。