微流控纸芯片显色法检测图像处理方法的比对*
2023-07-06郑志鸿夏敏珠李一冰
郑志鸿,夏敏珠,李一冰,张 剑
(西安医学院 药学院,陕西 西安 710021)
1990年Manz等首次报道提出微全分析系统(Micro totalanalysis system,μTAS),其最大限度地将分析实验室的功能转移至便携设备或芯片中[1]。微流控纸芯片法(Microfluidic paper-based analytical devices,μPADs)由Whitesides研究小组于2007年首次提出[2],是全微分分析方法的重要分支。该方法用纸张代替了玻璃、硅、高聚物等基底材料,通过各种加工技术,在纸上加工出具有一定结构的亲水或疏水微细通道网络及相关分析器件,构成了“纸上微型实验室”(lab-on-paper)[3]。目前,μPADs常用于定量分析,应用最广的为比色法等[4],通常以RGB均值表征显色强度并将其用于定量分析[5-8]。RGB值是一种工业色彩模式,其中R、G、B分别代表红、绿、蓝即光的三原色,每种颜色强度值为0～255。生活中的任何色彩都可以通过专业仪器或RGB识别类App直接扫描以获取对应的一组RGB值[9]。
研究致力于以Gamma灰度值为桥梁构建μPADs定量分析新方法,从数据处理层面减小纸芯片定量分析误差。Gamma灰度值是以纯黑色为基准值,某一灰度与之相对的饱和度,理论为0～255。Gamma灰度值并不局限于表示黑白色组的深浅,任何颜色都可以通过其RGB值计算得到对应的Gamma灰度值,同一颜色深浅可以用Gamma灰度值大小量化[10]。因此,Gamma灰度值也可以用于量化纸芯片分析检测中显色物质颜色强度,目前未发现有相关文献报道。
1 实验部分
1.1 试剂与仪器
磷酸盐缓冲溶液(PBS):pH=7.2～7.4,广州和为医药科技有限公司;5,5′-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB或Ellman试剂):纯度≥98%,半胱氨酸(Cys):纯度≥99%,上海源叶生物科技有限公司。
电子天平:ES1035A,天津市德安特传感技术有限公司;iPhone XS Max手机:A2104,1200万像素,美国苹果公司;1号定性滤纸:英国Whatman公司;喷蜡打印机:Xerox Phaser 8400,美国富士施乐集团有限公司;热压机:G311,福建阿普莱斯电器有限公司。
1.2 实验原理
研究以人体危险因子Cys纸芯片分析检测为例[11]。Cys与DTNB在纸芯片上反应,最终显橙黄色,然后用手机对显色的纸芯片拍照,再进一步通过数码测色器App(Copyright Ⓒ2001-2020 Apple lnc.)分析得到对应的RGB值,对校正后的Gamma灰度值(Gray)计算见公式(1)。
(1)
式中:R、G、B分别代表红、绿、蓝的颜色强度。
现有的灰度值计算方法大都误差较大,并不能满足建立标准曲线的精度要求,因此实验运用的灰度值经过Gamma校正计算,精度可满足建立标准曲线,是目前最为准确的灰度值计算方法[12]。以RGB均值和Gamma灰度值分别建立标准曲线,用于检测未知样品浓度,并分析RGB均值法和灰度值法的优劣。
1.3 实验步骤
1.3.1 纸芯片的制作
用Inkscape 0.91App设计纸芯片结构图案,设计好的纸芯片用喷蜡打印机打印在定性滤纸上,然后于176.7 ℃下热压2 min,使滤纸表面粘附的蜡加热熔化后渗入滤纸内部,取出后冷却至室温。纸芯片设计图见图1。
图1 纸芯片设计图
由图1可知,黑色部分为打印的疏水区域,白色圆孔直径为6 mm。滤纸为载体的纸芯片,主要起到分离、吸附和拦截作用[6],使反应只能在白色区域进行,保证显色的均匀性和上样量的一致性。
1.3.2 溶液配制
精密称取0.060 51 g的Cys,用PBS(pH=7.2～7.4,20 mmol/L)溶解定容至50 mL容量瓶,得10 mmol/L Cys储备液;用PBS稀释Cys储备液分别得0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mmol/L标准溶液;分别用PBS稀释Cys储备液至0.45、0.65 mmol/L得到样品1和样品2;精密称取0.100 00 g DTNB溶解于约15 mL PBS中,加入ρ(NaOH)=0.001 g/mL溶液调节pH=6.81至全溶,再定容至25 mL,得ρ(DTNB)=4 mg/mL溶液。
1.3.3 纸芯片上显色反应及数据处理
用移液器依次加载Cys与DTNB各3 μL至图1纸芯片圆形反应区,两者反应2.5 min后手机拍照记录结果;用数码测色计App识别并记录其对应RGB值,每次在显色区域中心附近随机取5个点的RGB值。然后分别测量计算样品1和2的RGB均值和Gamma灰度值,利用对应标准曲线测得样品1和2的浓度。样品1和2各测量5次,分别取平均值作为最终测量浓度,并计算其绝对误差、相对误差和相对标准偏差(RSD)。
2 结果与讨论
2.1 标准曲线
RGB值和Gamma灰度值的标准曲线见图2。
c/(mmol·L-1)
由图2可知,RGB均值法标准曲线方程为y=82.333x+27.06,R2=0.998 6,线性范围为0.3～1 mmol/L;Gamma灰度值法标准曲线方程为y=77.976x+22.402,R2=0.999 4,线性范围为0.2～1 mmol/L。运用Gamma灰度值法量化纸芯片的显色强度,线性关系优于RGB均值法,R2增大了0.08%,线性范围增加了14.29%。另外Gamma灰度值法从数据处理层面减小了微流控纸芯片定量分析的实验误差。两者均具有上样量小,灵敏度高的特点,且使用过程中无需大型仪器[13-15]。
2.2 误差与分析
样品1和2的实际浓度分别为0.45、0.65 mmol/L,测定误差与偏差见表1。
表1 2种方法的误差与精密度数据1)
由表1可知,其中样品1为低浓度样品,Gamma灰度值法和RGB均值法RSD均偏大,是由于溶剂打湿纸芯片后使背景值增加过大,且手机摄像头采集精度有限,因此低浓度样品显色较浅时,精密度会有所下降。
3 结 论
RGB均值法数据处理简单,误差较Gamma灰度值法稍大。Gamma灰度值法较为复杂,但线性关系更好,在实际应用中均能满足要求,可根据具体情况进行选择。2种方法均基于纸芯片的定量分析,具有上样量小、灵敏度高、操作简单、便携度高等诸多优势。使用过程中无需大型仪器,对实际样品的检测速度快,具有较好的应用前景。
