Hg2+介导的碳量子点荧光关-开法检测同型半胱氨酸*

吴易雨格,龚凌益,陈盈盈,彭 灿,王 晨,贺茂芳,2,秦 蓓,2,张 博,2**

(1.西安医学院 药学院,陕西 西安 710021;2.西安医学院 药物研究所,陕西 西安 710021)

同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)在体内不能合成,由进食含硫基氨基酸的蛋白质在体内代谢生成[1]。致病机理主要包括损伤血管内皮细胞、促进血管平滑肌细胞增殖、影响凝血系统及脂质代谢[2],高同型半胱氨酸血症(高于15 mmol/L,HHcy)可导致心脑血管、神经系统等多种疾病[3-8]。目前,同型半胱氨酸最主要的2种检测方法为高效液相(HPLC)法和荧光偏振免疫检测(FPLA)法[9-10],但这些方法操作繁琐、仪器昂贵、需要专业的操作者等因素难以推广使用。因此,开发一种操作便捷、低成本且具有高选择性、高灵敏度的Hcy检测方法尤为重要。

荧光碳量子点(carbon quantum dots,CQDs)是继富勒烯、碳纳米管及石墨烯之后最热门的碳纳米材料之一[11]。这种纳米材料可应用于潜指纹的增强成像[12],强灵敏的荧光响应可用于检测环境污染物[13],与传统半导体量子点相比,具有良好的生物相容性、无毒、环境友好等特点,在细胞内可用于Fe3+、Cu2+等的微量检测[14-15]。研究以柠檬酸为碳源、乙二胺为氮源,采用一步水热法合成氮掺杂碳量子点,构建CQDs-Hg2+猝灭体系,以Hg2+介导建立关-开法,可高效地控制碳量子点荧光的猝灭与恢复,为同型半胱氨酸的检测提供了新思路。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

柠檬酸:天津市天力化学试剂有限公司;同型半胱氨酸:上海源叶生物科技有限公司;乙二胺、七水合硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)、五水合硫酸铜(CuSO4·5H2O):上海市国药集团化学试剂有限公司;硝酸铬、硝酸铅、氯化锌:天津市河东区红岩试剂厂;无水氯化钙:天津市科密欧化学试剂有限公司;三氯化铁:上海麦克林生化科技有限公司;甲醇:天津益力化学试剂有限公司;氯化汞:贵州省铜仁化工研究所;以上试剂均为分析纯;去离子水:实验室自制;透析袋:500 Da,西安优博生物科技有限公司。

荧光分光光度计:F-4600,日本株式会社日立高新技术科学那珂事业所;紫外-可见分光光度计:Cary60,美国安捷伦科技有限公司;傅里叶变换红外光谱仪:TENSOR27,德国布鲁克公司;鼓风干燥箱:DHG-9245A,真空干燥箱:DZF-6050,上海一恒科学仪器有限公司;冷冻干燥机:LAB-1C-50,上海甄明科学仪器有限公司;电子天平:SQP,赛多利斯科学仪器北京有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 荧光碳量子点的合成

参考文献[15]的合成方法,修订了纯化方法。称取柠檬酸约4.0 g溶于40 mL的去离子水中,加入2.0 mL乙二胺,搅拌超声溶解,充分混匀后转移至100 mL聚四氟乙烯反应釜,拧紧密封,置于鼓风干燥箱中200 ℃反应3 h。反应结束后,烘箱温度自然冷却至低于50 ℃,取出深棕色的制备液装入500 Da透析袋中,外透析液采用去离子水,间隔10 min更换,透析约2 h,得到黄色澄清碳量子点内透析液。内透析液平铺于培养皿中,液层厚度小于10 mm,在冰箱中先冻冰,然后再真空冷冻干燥,即得碳量子点棕色粉末,于冰箱冷冻保存。

1.2.2 构建CQDs-Hg2+猝灭体系

配制2.0 mg/mL CQDs、10 mmol/L Hg2+和10 mmol/L Hcy作为储备液,t=4 ℃保存备用。取85 μL CQDs储备液至100 mL容量瓶中,加去离子水稀释至质量浓度为1.7 μg/mL;分别取1.0 mL Hg2+、Hcy储备液至10 mL容量瓶中,加去离子水稀释至浓度为1 000 μmol/L作为工作液。

以340 nm为激发波长(λex),438 nm为荧光波长(λem),激发和发射狭缝宽度均为5 nm。取2.0 mL CQDs工作液,加入到荧光比色杯中,测定荧光强度F0,再加入Hg2+工作液250 μL,摇匀,静置15 min,测定荧光强度Fq。依据ΔF1=F0-Fq计算荧光强度差值。

1.2.3 荧光关-开法检测Hcy

在荧光比色杯中加入CQDs工作液2.0 mL,Hg2+工作液250 μL,摇匀并静置15 min,测定荧光强度Fq。再加入Hcy工作液,混合均匀,在室温下静置10 min,测定恢复的荧光强度Fr。依据ΔF2=Fr-Fq计算荧光强度差值。

2 结果与讨论

2.1 碳量子点的表征与光学性能

量子点的合成方法和光学性能参考文献[15],修订的纯化过程见1.2.1。

2.2 猝灭体系的筛选

选择Cu2+、Fe3+、Fe2+、Zn2+、Hg2+、Cr3+、Ca2+、Pb2+(其他离子与1.2.2中Hg2+的配制和检测条件一致)8种金属离子,分别考察对CQDs的猝灭行为,并研究加入Hcy后的恢复效果。记录各离子加入后CQDs的荧光强度,通过比较筛选出Hg2+和Fe3+猝灭效果最好,见图1。制备CQDs-Fe3+和CQDs-Hg2+2种猝灭体系,分别加入Hcy 150 μL,按照η=(Fr-Fq)/Fq计算恢复率,最终筛选出合适体系,见图2～图3。

图1 不同金属离子对CQDs猝灭效果

λ/nm

λ/nm

由图1～图3可知,Fe3+对CQDs的荧光猝灭效果最好,其次是Hg2+,但在后续的荧光恢复实验中,CQDs-Fe3+体系恢复效率低,不能达到预期效果,因此将其淘汰。然而,CQDs-Hg2+体系的恢复率可以达到51%,通过Hg2+介导,利用荧光信号关与开的特点,从而实现对Hcy的检测,因此,选择CQDs-Hg2+体系。

2.3 CQDs-Hg2+体系优化

在实验中发现,ρ(碳量子点)较高时,荧光强度大,随着Hg2+加入量逐渐增加,猝灭现象会越发明显,但是在Hcy加入后恢复效果并不理想,推测在溶液中,碳量子点的微观分散颗粒数与Hg2+的数目存在某种匹配性,在该条件下,加入Hcy,才有利于荧光恢复。

2.3.1 优化ρ(碳量子点)

通过稀释碳量子点储备液,选择荧光强度F0=200、300、600附近3种质量浓度(1.2、1.7、3.4 μg/mL)的碳量子溶液2.0 mL,分别加入200 μL Hg2+工作液,摇匀,静置15 min,充分反应后测定荧光强度Fq。依据η=(F0-Fq)/F0计算荧光猝灭率,考察ρ(碳量子点)对猝灭率的影响,见图4。

ρ(碳量子点)/(μg·mL-1)

由图4可知,碳量子点荧光强度F0≈200,猝灭率约为42%,F0≈300,猝灭率约为50%,ρ(碳量子点)进一步增大,F0≈600,猝灭率没有提高,反而降低至约23%,说明ρ(碳量子点)进一步增加,由于碳量子点的微观分散颗粒数更多,不利于Hg2+对其猝灭。因此,选择F0≈300的ρ(碳量子点)=1.7 μg/mL作为工作液。

2.3.2 优化V(Hg2+)

在荧光比色杯中加入CQDs工作液2.0 mL,分别加入50、100、150、200、250、300 μL Hg2+工作液,摇匀并静置15 min,测定荧光强度Fq,分析不同V(Hg2+)对碳量子点的猝灭率的影响,见图5。

λ/nm

由图5可知,碳量子点溶液中加入Hg2+后,荧光强度随着V(Hg2+)的增加,开始下降,且猝灭程度随V(Hg2+)的增加不断加大。V(Hg2+)=250 μL,猝灭率约为51%,继续加入Hg2+,猝灭率无明显变化,荧光光谱基本重合。考虑到后续荧光强度恢复效率和线性范围,最佳体积为V(Hg2+)=250 μL。

2.4 荧光猝灭反应时间动力学

将250 μL Hg2+加入到2.0 mL碳量子点溶液中,室温下改变反应时间,考察其对荧光猝灭效果的影响,结果见图6。

猝灭反应时间/min

由图6可知,随着时间的延长,荧光强度先下降后保持稳定,反应时间为15 min,荧光强度基本不变达到动态平衡,因此后续研究选定猝灭时间为15 min。

2.5 荧光恢复反应时间动力学

在2.0 mL碳量子点溶液中加入250 μL Hg2+,猝灭反应15 min,然后将Hcy 20 μL加入该猝灭体系中,改变反应时间,考察其对荧光恢复效果的影响,结果见图7。

荧光恢复时间/min

由图7可知,开始加入Hcy,荧光迅速恢复,说明Hcy能够很好地竞争性结合Hg2+,使荧光信号得以恢复。由于体积和微粒分散性的变化,荧光强度有一定波动,但随着时间延长,反应时间为10 min,荧光强度趋于平衡,最佳荧光恢复时间为10 min。

2.6 建立荧光关-开方法

精密移取CQDs工作液2.0 mL,Hg2+工作液250 μL,加入荧光比色杯,摇匀并静置15 min,待猝灭完全后测定荧光强度Fq。再加入Hcy工作液,使c(Hcy)=3、5、7.5、10、15、17.5、20 μmol/L,混合均匀,在室温下静置10 min,以340 nm为激发波长,438 nm为荧光波长,测定恢复的荧光强度Fr。依据ΔF2=Fr-Fq计算荧光强度差值,结果见图8。

c(Hcy)/(μmol·L-1)

由图8可知,c(Hcy)=3～20 μmol/L,碳量子点的荧光恢复程度与c(Hcy)呈现良好的线性关系,线性回归方程为y=7.059 4x-19.647,相关系数r=0.998 5,检测限为0.06 μmol/L。

3 结 论

实验以乙二胺为氮源、柠檬酸为碳源,采用一步水热法合成氮掺杂碳量子点探针(CQDs)。该纳米材料在激发波长为340 nm、荧光波长为438 nm时具有很好的荧光强度,同时对Hg2+表现出选择性的荧光猝灭效应,而Hcy可竞争性结合Hg2+,使碳量子点的荧光得以恢复,以荧光强度恢复程度和同型半胱氨酸浓度为线性关系,建立Hg2+介导的碳量子点荧光关-开法测定同型半胱氨酸,该方法具有选择性好、灵敏度高的优点,可用于测定同型半胱氨酸。