艾司唑仑体内分布1 例

杨士云，张瑛，乔静，罗璇

1.北京市公安司法鉴定中心 法庭毒物分析公安部重点实验室，北京 100192；2.北京市公安局通州分局刑事侦查支队，北京 101100

1 案 例

1.1 简要案情

某男，68 岁，有抑郁症病史2 年，长期使用艾司唑仑。某日上午，其子陪该男去医院开了3 盒艾司唑仑（共60 片，每片1 mg）。11：00 许其子送该男回到小区门口，30 min 后其子联系不上该男，家中也没发现在医院开的药物。3 d 后，在距离小区约500 m 处的河内发现该男尸体，已轻度腐败，经尸表检查，未发现可疑中毒现象。行尸体解剖，同时提取心血（20 mL）、胃内容物（50 g）、尿液（15 mL）送检，要求检验血液中是否有乙醇和镇静催眠药、胃内容物中是否有镇静催眠药、尿液中是否有毒品。经尸体检验并结合毒（药）物检验结果判定该男为溺死。为进一步了解上述毒（药）物在体内的分布情况，继续送检玻璃体液、肝、肺、肾、心、脾、脑、腹壁肌肉和头发检材。

1.2 材料与方法

1.2.1 主要试剂和仪器

LC-Q ExactiveTMHF 组合型 四 极 杆Orbitrap 高分辨质谱联用仪（美国Thermo Fisher Scientific 公司），GL-21M 高速冷冻离心机（上海卢湘仪离心机仪器有限公司），AL104 分析天平（瑞士Mettler Toledo 公司），VORTEX 2 涡旋混匀器（德国IKA 公司），JXFSTPRP-24 组织研磨仪（上海净信实业发展有限公司），孔径为0.22 μm 的有机系针式过滤器（北京八方世纪科技有限公司），Milli-Q Advantage A10 超纯水系统（美国Millipore 公司）。

艾司唑仑标准物质（10 mg，99.0%），乙腈、甲醇、甲酸和甲酸胺（色谱纯，德国Merck 公司），超纯水由Milli-Q Advantage A10 超纯水系统制备。

1.2.2 样品及标准品

样品为本例尸体的心血、胃内容物、尿液、玻璃体液、肝、肺、肾、心、脾、脑、腹壁肌肉和头发。

选择日常受理的1 例经鉴定明确为猝死且常规毒（药）物检验为阴性的心血和肝组织作为空白对照，添加标准物质进行质量控制。

1.2.3 前处理方法

心血、尿液、玻璃体液各取0.5 mL，加入1 mL 甲醇乙腈溶液（甲醇体积分数为20%）；各器官（肝、肺、肾、心、脾、脑）及腹壁肌肉组织匀浆，各取0.5 g，加入1 mL 甲醇乙腈溶液。所有样品超声振荡10 min，以离心半径8.2 cm，14 000 r/min，离心10 min，上清液经有机系针式过滤器过滤后行液相色谱-高分辨质谱（liquid chromatography-high resolution mass spectrometry，LC-HRMS）分析。

胃内容物取0.1 mL，加入0.9 mL甲醇乙腈溶液，涡旋振荡1 min，在4 ℃下，以离心半径8.2 cm，14 000 r/min，离心10 min，取上清液0.1 mL，加入0.9 mL甲醇乙腈溶液混匀，经有机系针式过滤器过滤后行LC-HRMS 分析。

头发依次用水、洗洁精、水冲洗干净后晾干，剪成1 cm左右的小段。称取2份，一份0.1 g，一份0.2 g，分别用研磨仪研碎，加入1.5 mL 甲醇超声提取1 h，然后在4 ℃下，以离心半径8.2 cm，14 000 r/min，离心10 min，取上清液经有机系针式过滤器过滤后行LC-HRMS分析。

取0.5 mL 空白血液若干份、0.5 g 空白肝组织若干份，分别加入30、50、100、200、500、1 000 ng 艾司唑仑，每个浓度点同时添加两个样品，平行操作。将样品涡旋混合均匀后，与未添加标准物质的空白血液均加入1 mL 甲醇乙腈溶液，超声振荡10 min，在4 ℃下，以离心半径8.2 cm，14 000 r/min，离心10 min，上清液经有机系针式过滤器过滤后行LC-HRMS 分析。此操作与实验样品同时进行。

1.2.4 乙醇、毒品及镇静催眠药的分析方法

按照检验要求，用顶空气相色谱法进行血液中乙醇的检验；用酶免疫分析技术对尿液中常见毒品进行分析；针对镇静催眠药，胃内容物和血液经乙酸乙酯液液提取浓缩后进行GC-MS 分析，经甲醇乙腈溶液沉淀蛋白后进行LC-HRMS 分析。其他检材经甲醇乙腈溶液沉淀蛋白后进行LC-HRMS 分析。

1.2.5 实验条件

色谱条件：ACQUITY UPLC HSS C18 色谱柱（2.1 mm×150 mm，1.8 μm；美国Waters 公司）。流动相A 为2 mmol 甲酸铵、0.01%的甲酸水溶液，流动相B 为甲醇，梯度洗脱，共19 min。洗脱程序：0～0.5 min 10%B，0.5～5.5 min 10%B～45%B，5.5～9.5 min 45%B，9.5～13.0 min 45%B～90%B，13.0～16.5 min 90%B，16.5～19.0 min 10%B。流速0.3 mL/min，柱温35 ℃，进样量5 μL。

质谱条件：采用加热电喷雾电离（heated electrospray ionization，HESI）正离子模式，喷雾电压3.8 kV，电子能量为30、50、90 eV，离子源温度320 ℃，传输线温度350 ℃，采用一级全扫描和数据依赖二级扫描模式（Full mass/ddMS2），质量分辨率60 000，自动增益控制（automatic gain control，AGC）为106，扫描范围为m/z100～1 000。

1.3 检验结果

经毒（药）物检验，在该男心血中未检出乙醇成分，尿液中未检出苯丙胺类、大麻类、吗啡、氯胺酮、可卡因等常见毒品，心血、胃内容物、尿液、玻璃体液、肌肉、头发及各器官中均检出艾司唑仑成分，含量分别为：尿液0.05 μg/mL，血液0.24 μg/mL，胃内容物7.53 μg/g，脑0.45 μg/g，肾0.58 μg/g，肺1.08 μg/g，玻璃体液0.11 μg/mL，肝2.35 μg/g，心脏0.45 μg/g，脾1.73 μg/g，肌肉0.41 μg/g，头发0.32 μg/g。此外，在心血、肝、肺、肾、心、脾、脑和腹壁肌肉中出现疑似羟基艾司唑仑的准分子离子峰，在尿液、胃内容物、玻璃体液、头发中未出现羟基艾司唑仑的准分子离子峰。肝组织中艾司唑仑及其代谢物羟基艾司唑仑的相关谱图见图1～3。

图1 肝组织中艾司唑仑及羟基艾司唑仑的色谱图Fig.1 Chromatograms of estazolam and hydroxyestazolam in liver

图2 肝组织中艾司唑仑的质谱图Fig.2 Mass spectrum of estazolam in liver

图3 肝组织中羟基艾司唑仑的质谱图Fig.3 Mass spectrum of hydroxyestazolam in liver

2 讨论

艾司唑仑又名舒乐安定，属于苯二氮䓬类镇静催眠药，是临床上应用非常广泛的一种药物，可用于各种类型的失眠，其作用时间适中，催眠作用强，口服后20～60 min 可入睡，维持5 h，在临床上被广泛用于抗焦虑、缓解术前紧张以及抗癫痫、抗惊厥等方面，还可用于紧张性头痛。由于艾司唑仑使用广泛，由此引起的不良事件时有发生，麻醉后抢劫、强奸以及中毒和死亡的案件频发[1-3]。由于检材的不易获得性，国内对艾司唑仑的研究多为血液和尿液。本例除了对血液和尿液进行分析外，还对艾司唑仑在体内器官中的分布进行了研究。2016 年，LIU 等[4]对一起采用艾司唑仑和海洛因杀人的案件进行了分析，在死者体内检出6-单乙酰吗啡、吗啡和艾司唑仑成分，并对这3种物质在体内的分布进行了分析，艾司唑仑在肝组织中聚集（1 080 ng/g），在血液中质量浓度为797 ng/mL，其次是肺、肾、肌肉、心肌和脑，最后此案的死因被确定为与滥用毒品相关。本例死者生前服用了艾司唑仑，血液中艾司唑仑质量浓度为0.24 μg/mL，低于已报道的中毒质量浓度（1.25 μg/mL）[5]，高于治疗质量浓度（0.055～0.2 μg/mL）[5]；而在胃内容物中质量浓度为7.53 μg/g，说明死者在服用艾司唑仑后不久便死亡，药物尚未被完全吸收；头发和肌肉中均检出艾司唑仑，证实死者长期使用该药物。此外，在肝组织中还检出了艾司唑仑的代谢物羟基艾司唑仑。本例法医判定的死亡原因为溺死，与此检验结果及案情吻合。尸体在水中浸泡3 d，不排除存在药物再分布现象。本例中，从体内分布结果来看，检验艾司唑仑的较佳检材是血液、胃内容物、肝组织和脾组织，但其体内分布与服药时间、死亡时间密切相关。

本例在定性分析中，为防止漏检、保证药物均能有效检出，采用了液液提取、浓缩、复溶的模式；而在定量分析中，直接采用甲醇乙腈溶液（甲醇体积分数为20%）沉淀蛋白，离心、过有机系针式过滤器后直接用于定量分析，减少了实验环节，使药物定量更准确。