动物DNA 分型及其在法医学中的研究进展

高红艳，刘光甫，吴建，陈鹏宇

1.平顶山学院医学院，河南 平顶山 467000；2.重庆市人口和计划生育科学技术研究院，重庆 400020；3.遵义医科大学附属医院，贵州 遵义 563000

随着分子生物学及DNA 检测技术的发展，非人源DNA 分析作为传统法医DNA 分析的补充，拓宽了法医DNA 分析技术的应用范围，便于全面利用各种生物物证，提高在案件侦破过程中提供线索和证据的能力。非人源DNA 的检测和鉴定日益成为法医学研究的热点，对各类动物、植物、微生物的非人源DNA 研究日渐增多。动物与人类活动关系最为密切，动物DNA 分型在各类非人源DNA 相关案件侦破中发挥的作用最为突出，是法医学非人源DNA 分析的主要内容。

动物DNA 分型，技术的发展经历了从形态学检测到显微镜检验、理化检验、蛋白分析和免疫学鉴定等表达产物水平的检测方法[1]，尽管这些方法具有直观、简便且价格低廉的优势，但是受限于鉴别能力的严重不足，难以满足实际应用的需求。伴随着PCR技术的诞生以及多样化的DNA 检测技术的发展，检测DNA 分子标记成为最具有应用价值的技术方法，展现出以往的遗传标记分析无法比拟的优势。动物DNA 分型技术具有高效、准确、高识别力的特点，可以进行物种鉴定、个体识别、亲缘分析等，甚至可以对严重腐败、降解、污染等传统鉴定技术束手无策的检材进行鉴定，可以应用于法医学的多种场景，是目前最为可靠且有效的动物鉴定方法[2]。

动物DNA 分型及法医学应用与人类DNA 分型应用的要求和特征有诸多一致之处，主要表现在DNA分型的原理和方法、分型结果证据意义的评估。然而，动物DNA 相对于人类DNA 的应用要少得多，这也导致其在分型技术标准化、基础数据库建设以及证据价值评估方法等方面有诸多不完善之处，在实际应用中面临挑战和争议，需要进一步加以完善和解决。因此，本文就动物DNA 分型在法医学应用中的相关内容进行综述。

1 动物DNA 分型技术

随着2001 年人类基因组计划的顺利完成，动物基因组计划也取得了相应进展，基因组数据日益增多[3]。其中，美国于2003 年首次公布了与人类关系最为密切的犬的基因组序列草图[4]，其他常见的家养动物（如马、猫、牛和猪）的基因组图谱也相继绘制完成。此外，法庭科学中可能涉及的珍稀野生保护动物（如大熊猫、藏羚、扬子鳄和东北虎等），也已陆续获得相应的基因组数据，便于进行各种分子生物学的研究。

DNA 序列分析是对DNA 一级结构的分析，简称为DNA 测序。如经典的Sanger 双脱氧链终止法和二代测序，在探索生命奥秘、准确获取生物遗传信息中发挥着重要的作用。姚瑞[5]采用高通量测序技术鉴定了30 种大型底栖动物，对生物多样性的维护与规划起到了非常重要的参考作用。目前，动物DNA 分型与人的DNA 分型方法基本类同，在核DNA 和mtDNA 水平上，通过对不同类型的遗传标记进行分型检测，为案件提供线索和证据。这些遗传标记主要包括STR、SNP、InDel 和微单体型。不同的遗传标记，结合不同的检测方法，在法医学中展现出不同的应用价值[6]。

1.1 STR 分析

与人类DNA 分析一样，STR 基因座也是动物DNA 分析中应用最为广泛的长度多态性遗传标记[7]。2011 年国际法医遗传学会（International Society for Forensic Genetics，ISFG）为规范法医遗传学调查中使用动物DNA，提出了13 条建议，包括样本的收集、目标序列的验证、遗传标记的选择、引物序列的筛选、种内和种间特异性的验证、重复性试验等[8]。ISFG 还提出，动物STR 分型采用与人STR 分型一致的法医物证公认的理论与技术，如以重复次数命名等位基因、STR 基因座筛选时首选四核苷酸重复的序列、使用等位基因分型标准品（ladder）作为命名参照，同时需要有研究群体的遗传结构数据作为证据评估的基础，并考虑多种假设、采用似然比方法评估证据权重等。ISFG还强调了常规开展动物DNA 检验的实验室应进行相应的资格认证，我国公安部于2019 年发布了《法庭科学 犬DNA 实验室检验规范》（GA/T 1703—2019），规定了法庭科学犬DNA 实验室检验应遵守的基本要求，为我国从事法庭科学犬DNA 检验的实验室提供了基本的行业标准。

对于动物STR 分型的法医学应用，同样采用个体识别率（discrimination power，DP）和非父排除率（probability of exclusion，PE）为指标评价遗传标记在个体识别和亲权鉴定中的系统效能。一般情况下，遗传标记的数量越多，遗传标记组合在群体中出现重复的概率越小，个体识别能力就越强[9]。针对狗[10]、猫[11]、马[12]、牛[13]、熊[14]、鸟[15]等动物的个体识别和亲权鉴定，目前已筛选出若干STR 基因座并建立了相应的法医DNA 分型体系和数据库。其中，与人类关系最为密切的几种家养动物中，狗的STR 遗传标记多达67 个，包括66 个常染色体STR 基因座（REN285G14、REN112I02、REN172C02、REN143K19、FH2890、CO2.466、FH3895、REN157C08、C03.445、FH2732、FH2776、REN160J02、REN92G21、REN285I23、CO5.414、FH2752、REN37H09、REN87M11、REN286L19、REN204K13、CO8.373、CO8.618、C09.173、C09.474、FH2885、C10.781、REN73F08、REN154G10、REN164B05、C11.873、REN208M20、REN94K11、REN286P03、C13.758、C14.866、FH3802、REN06C11、REN144M10、REN85N14、C17.402、REN50B03、REN112G10、FH2783、REN91I14、REN274F18、FH3109、FH3069、REN107H05、FH3078、C23.277、REN181K04、REN106I06、FH3083、REN87O21、C27.436、FH2782、REN239K24、FH3082、REN51C16、FH3053、FH3060、REN314H10、REN112C08、REN106I07、FH2708和VWFX）和1 个性染色体STR 基因座（Amelogenin）；猫的STR遗传标记有31个（FCA176、FCA723、FCA084、FCA764、FCA139、FCA105、FCA102、FCA322、FCA823、FCA700、FCA275、FCA356、FCA848、FCA391、FCA736、FCA1056、FCA480、FCA310、FCA1390、FCA920、FCA1239、FCA221、FCA976、FCA742、FCA987、FCA096、FCA085、FCA1014、FCA1015、FCA1016、FCA1315）；牛和马的STR 遗传标记分别为16 个（TGLA227、BM2113、TGLA53、ETH10、SPS115、TGLA126、TGLA122、INRA23、ETH3、ETH225、BM1824、BM1862、BM720、BMc701、BM2934、BM861）和17 个（AHT4、AHT5、ASB2、ASB17、ASB23、HMS2、HMS3、HMS6、HMS7、HTG4、HTG10、VHL20、CA425、HMS1、HTG6、HTG7和LEX3），可达到法医物证检验要求的个体识别率和非父排除率。

自1996 年起，美国Applied Biosystems 公司开始生产用于犬类研究的含有10 个STR 基因座的商品化荧光标记试剂盒，随后又继续研发包含有猫、牛、马等动物STR 基因座的个体识别试剂盒[16]。但是，动物STR 分型体系的研发及应用远远不及人类STR 分型成熟，在基因座的选择、样本的收集、高质量基因组数据的可获得性以及经费支持等方面仍有待提高。

1.2 SNP 分析

SNP 是指单个核苷酸变异而呈现出序列多态性的遗传标记。与STR 基因座相比，虽然SNP 位点的信息量较小，但因其在基因组中含量丰富、分布密集，具有突变率低、检测自动化程度高、适用于高度降解DNA 样本等优势，被认为是继STR 后最有潜力的第三代遗传标记[17]。

对动物SNP 的研究，VERSCHEURE 等[18]通过对346 只犬的26 个SNP 位点进行统计分析，计算得出的非父排除率可达到97%。日本学者TOZAKI 等[19]利用全基因组SNP 基因型数据，比较了32 个国际马品种、8 个日本本土马品种和日本纯种马品种的遗传多样性，从遗传多态性和期望杂合度来看，除北海道外，日本本土马品种的多样性相对较低；而系统发育和聚类分析结果表明，不同品种马之间的关系很大程度上反映了其在日本的地理分布，为推测群体遗传关系和进化提供了参考数据。BA 等[20]使用双酶切限制性位点关联DNA 测序（double digest restriction-site associated DNA sequencing，ddRAD-seq）技术在42 只无关梅花鹿中共检出96 188 个SNP 位点，分析发现，大多数位点存在杂合子缺失和期望杂合度值较低的现象，可能与动物近亲交配和Wahlund 效应（即当一个群体被隔离为多个亚群后，亚群的杂合子比例低于总群体处于Hardy-Weinberg 平衡时的杂合子比例）有关。使用SNP 深入研究梅花鹿的遗传多样性，对梅花鹿的遗传管理具有重要意义，同时也为特殊种群的资源培育提供了有效的依据。

1.3 InDel分析

InDel 是由于DNA 片段的插入或缺失而形成的长度多态性遗传标记，和SNP 一样，属于二等位基因遗传标记。InDel 由于其自身扩增片段短，因而对于陈旧、降解的生物检材有特殊的应用价值。

在动物InDel 研究中，袁文华[21]收集了381 只犬科个体，通过分析和研究家犬驯化过程中群体InDel结构变异的遗传进化特征，鉴别出了在家犬驯化过程中受到人工选择作用而发生快速进化的InDel 候选基因NOCT（nocturnin）和髓鞘碱性蛋白（myelin basic protein，MBP），为深入理解家犬的种族起源、驯化历史以及其他家养动物的进化机制研究提供了新的数据，也为临床研究人畜共患病的分子机制提供了参考依据。薛蕾[22]对3 个群体12 只山羊个体的全基因组InDel 位点进行分析，结果显示，平均每只个体高质量的InDel位点为334 151个；rs668795676和rs657996810位点为大足黑山羊群体特有，rs669452874 位点为内蒙古绒山羊群体特有；在rs669452874 位点上，山羊的体质量和胸部深度差异有统计学意义（P＜0.05）。GAO 等[23]在陕北白绒山羊群体中，在海马丰富转录物1（hippocampus abundant transcript 1，HIAT1）基因的第一个内含子中选择了一个15 bp 的插入位点（rs665862918），研究结果显示，rs665862918 位点在不同羊群的胸部宽度、胸部深度、心脏周长、身体长度等指标中差异有统计学意义（P＜0.05）。进一步分析发现，rs665862918位点的插入/插入型个体的生长性状表现优于插入/缺失型或缺失/缺失型个体。这些结果证实了HIAT1基因与山羊体型的相关性，rs665862918位点作为山羊生长性状的潜在分子标记，有望应用于山羊优良品种的开发。

1.4 mtDNA 分析

当细胞核DNA 量不足或降解严重而无法进行分型时，可以使用mtDNA 进行分析[24]。法医学动物DNA分析中针对mtDNA 最成熟和广泛的应用之一，是通过DNA 条形码技术进行物种鉴定。DNA 条形码技术是利用生物体内一段标准DNA 序列作为标记来实现准确、快速和自动化的物种鉴定方法，理想的DNA 条形码应满足以下3 个条件[25]：（1）具备足够的种间变异性，并能够稳定遗传的基因序列，以区分不同的物种；（2）具有高度保守的DNA 序列区域，便于通用引物的设计；（3）目标DNA 区域足够短（300～800 bp），便于降解DNA 的扩增。此外，还可使用mtDNA 对动物进行系统发育树的构建，探讨其祖先来源[26]。

2001 年，COX[26]首次提出了DNA 条形码的初步使用方案，随后，对DNA 条形码的研究在不同领域获得了迅猛的发展。目前，生命条形码联盟（Consortium for the Barcode of Life，CBOL）建立了DNA 条形码数据库，便于以DNA 序列为检测对象的物种鉴定，极大地增强了人类了解、监测和使用生物多样性资源的能力，在生命科学、法医学、生物学等多个领域具有广泛的应用前景[27]。

但是，由于mtDNA 多态性较低、母系遗传、存在异质性和分析技术繁琐等问题，一般只在涉及低拷贝核基因组DNA 的样本（无毛囊的毛发、骨头、粪便等）、降解检材无法进行STR 分型或者分型失败时才需进行mtDNA 分型，与STR 直接认定的分析结果相比，mtDNA 分析的法医学价值主要在于排除[28]。

2 动物DNA 分析在法医学中的应用

2.1 案件的无声证人

据统计，我国养狗与养猫的人数占比分别为46.1%和30.7%，且年增长速度保持在10%以上[29]。因此，动物与人类之间有着非常密切的关系，在各类涉及动物的案件中，理论上可以通过动物毛发、咬痕、排泄物等生物成分，建立动物-案犯与案发现场之间的联系，如嫌疑人可能携带受害人宠物的毛发，也可能将自己宠物的毛发留在案发现场。根据一项模拟犯罪的研究[30]，窃贼从受害者家里可携带数百根狗或猫的毛发，这些毛发在案件中可以作为无声的证人发挥作用。

2.2 动物袭击案件

家养宠物致人伤害甚至死亡的案例屡见不鲜，根据我国疾控中心发布的中国狂犬病防治现状，我国每年被狗或猫咬伤的人有上千万[31]。在动物袭击案件中，可提取被咬人咬痕处动物的唾液DNA 进行检验，从而判定动物主人的责任，在鉴定实践中发挥作用[32]。

2.3 野生动物保护

目前，野生动物走私与军火走私、毒品走私并列为三大非法交易[33]。野生动物的非法贸易不仅破坏了生物多样性，促使许多珍稀动物濒临灭绝，同时可以导致外来入侵物种破坏当地生态平衡，甚至一些野生动物携带的病毒向人类蔓延，威胁到人类公共安全[34]。在野生动物保护活动中，物种鉴定、地域溯源、死因分析等是必须解决的首要问题，也是立案侦查的依据，能够为刑事诉讼提供科学依据。目前，采用DNA分子标记技术对动物种属、动物损伤、动物痕迹等信息进行鉴定，已成为一种可靠、有效的方法，在野生动物保护法的执行中起到关键作用。目前，我国对犀牛角、象牙、濒危蛇类等基于DNA 条形码技术的多种物种鉴定取得了快速发展[35]。但从整体来看，我国尚未形成规范化的体系研究，限制了法医动物学研究的发展和进步。

2.4 动物的亲子鉴定

随着动物繁殖代数的增加，会在基因水平发生可累积的突变。在DNA序列上的差异，可采用医学、生物学、遗传学等方法对个体和亲代的遗传关系进行分析，以此进行动物的亲子鉴定。除了动物个体和亲代的毛发、毛色、体型等形态学标记，使用DNA 分子标记，可准确地反映物种之间亲缘关系的远近[36]。动物亲子鉴定最常用的遗传标记为STR。对动物进行亲子鉴定，国外研究相较于国内早且规范和成熟。LUIKART等[37]在1999 年使用22 个STR 位点对山羊进行亲子鉴定，结果显示，3 种山羊的累积非父排除率均大于0.999 9。ZHAO等[38]在2020年使用15个STR位点对老虎进行分析，结果显示，累积非父排除率和累积个体识别率分别达到0.999 999 472 和0.999 999 999 999 5。

2.5 其他应用

除了法庭科学中与侦查诉讼有关的案件，动物DNA 分析技术也可用于非诉讼的场景，如应用于兴奋剂调查中赛马的个体识别[39]、良种筛选及优育[40]、功能基因定位[41]、遗传疾病检测[42]、群体结构和遗传关系分析[43]以及克隆动物的身份鉴定[44]等。

3 动物DNA 分型面临的挑战

动物DNA 分型技术的起步很早，但是相对人类DNA 的应用仍比较少，在法医学实际应用中尚存在多方面的不足和挑战。因此，动物DNA 分析在法医学中的应用还需要进一步研究和完善。

3.1 动物DNA 分型技术的标准化

人类DNA 分型技术已相当成熟和规范，参照人类DNA 分型技术标准，ISFG 已于2011 年对动物DNA的法医学鉴定提出了相关建议[8]，但是分型标准仍未确定，很多常规实验室难以完成此类特殊样本的检测和分型，且有很多动物核心序列未公布，基因座的定位和判读也受到一定程度的制约。在数据共享、基因座优化、分型标准化等方面，仍需法医工作者不断探索和研究。

3.2 动物DNA 数据库的建立

目前国外已有一些小型动物DNA 数据库，政府也累积了一些动物DNA 案例，但是要满足日益增多的案件需求，需要的是更庞大的数据库[45]。部分动物，尤其是濒危野生物种，存在采样困难、数据误差大等问题，难以准确计算相关的法医学参数并进行DNA分型结果的证据价值评估。为了解决野外采样DNA难以持久保存的困难，2013年，CAMACHO-SANCHEZ等[46]对野外生物取样进行了研究，结果表明，在现场低温保存以确保DNA 或RNA 稳定性的效果并不满意，样本只能保存1 周左右，而使用核酸保存缓冲液（nucleic acid preservation buffer，NAP），样本至少可以保存2 个月。高质量的样本是获得高质量遗传数据的关键，动物DNA 数据库的建立也需要在保证样本质量的前提下开展。近期，STRBase（SRD-130）数据库（http://www.cstl.nist.gov/biotech/strbase/）除了人类STR 数据，还收集了猫、狗、牛、马等动物的STR 数据，便于实验室间的数据共享，其他实验室的分型数据也可以继续上传至该数据库，促进了动物STR 分型技术的进一步发展和标准化流程的制定，也为法医动物DNA 分型进行实验室序列化比对和种群识别提供了基础数据支撑。中国动物药材DNA 条形码数据库[47]首次构建了统一的中国动物药材DNA 条形码数据库，对动物药材鉴定、资源可持续利用和濒危物种保护均有重要意义。

3.3 动物DNA 分析的证据效能评估

与人类相比，动物具有杂交、回交和近交等特殊的繁殖方式[48]，会对基因座多态性的群体分布造成很大影响，在进行证据价值评估时，亚群之间的差异[49]、基因座连锁不平衡[50]、基因迁移等问题也需要关注。在法医学中，使用共祖系数[51]对来源于同一种群的两个个体进行遗传学图谱比对时，这两个个体具有相同的祖先即拥有同一等位基因的机会称为Fst或者θ。在人群中，Fst的范围是0.01～0.03[52]。当群体数量足够多时，拥有同一祖先的机会是非常小的，但是在非人类种群中情况有所不同，特别是在被隔离的小的野生动物种群、被驯养的动物种群、分布比较局限或者多配偶的动物种群中，拥有同一祖先的情况是非常普遍的[53]。因此，在证据效能评估时，选择Fst值小的遗传标记进行个体识别，选择Fst值大的遗传标记进行祖先推断。虽然在大多数情况下，个体或物种的DNA鉴定并不困难，但是相同的起源、密集的近亲繁殖和遗传漂变[54]使得界定物种品种或地理种群要困难得多，尤其是对于形态特征的遗传变异[55]导致的复杂性状背后的遗传学理论目前仍处于探索阶段。

总之，动物DNA 分析与人类DNA 鉴定有许多相似性，应用也日益广泛，目前已陆续报道了相关数据和案例，但是开展动物DNA 分型的法医学实验室仍然较少，法庭对其证据效能的信任度并不高，有时在数据分析、动物出庭作证、宠物主人认定等方面还会产生争议。此外，动物DNA 分析应用于法医学实践时，需要注意的问题也较多，如动物可能的近亲繁殖或遗传漂变对遗传标记多态性程度的影响，流浪动物难以追踪以及特别稀缺物种的数据不足等复杂问题。与人类DNA 分型相比，动物DNA 分型技术在标准化、DNA 数据库建设、DNA 分析证据效能评估等方面仍需进一步完善和研究。随着动物DNA 分型技术的不断发展和成熟以及法医学应用所需的上述基础工作的不断推进，动物DNA 分型势必将在更为广泛的鉴定实践中发挥越来越重要的作用。