衣康酸酐抗原修复液在改善前处理不佳组织的免疫组织化学染色结果中的应用研究

陈丽雅 王凤翔 邹琼瑜 廖鸿力

[摘要] 目的 探討衣康酸酐抗原修复液改善前处理不佳组织免疫组织化学（以下简称免疫组化）染色结果的效果。方法 收集2022年3～5月温州市中心医院术后病理标本68例，其中乳腺癌19例，肠癌32例，扁桃体17例。模拟前处理不佳的组织处理流程制作组织蜡块，每个病例每种标记抗体切片2张，根据随机数字表法分为对照组（使用乙二胺四乙酸抗原修复液）和实验组（使用衣康酸酐抗原修复液），对比两组的免疫组化染色结果。结果 通过实验选择4mmol/L的衣康酸酐作为抗原修复液。实验组与对照组的敏感度比较差异无统计学意义（P>0.05）；实验组免疫组化染色结果的特异性优良率显著高于对照组（92.48% vs. 76.69%，χ2=25.43，P<0.05）；实验组免疫组化染色的细胞形态显著优于对照组（χ2=13.60，P<0.01），对照组普遍出现皱褶、局部掉片、细胞肿大甚至严重变形、细胞膜/质/核定位不清晰；而实验组皱褶较少，几乎无掉片现象，细胞形态相对完整，细胞膜/质/核定位相对清晰。结论 当组织固定不及时或脱水流程出现问题，建议使用衣康酸酐抗原修复液以获得特异性及细胞形态较好的免疫组化染色结果。

[关键词] 衣康酸酐；免疫组织化学；固定；非特异性结合

[中图分类号] R446.8      [文献标识码] A      [DOI] 10.3969/j.issn.1673-9701.2023.16.016

Application of itaconic anhydride antigen repair solution in improving immunohistochemical staining results of poorly pretreated tissues

CHEN Liya， WANG Fengxiang， ZOU Qiongyu， LIAO Hongli

Department of Pathology， Wenzhou Central Hospital， Wenzhou 325000， Zhejiang， China

[Abstract] Objective To investigate the effect of itaconic anhydride antigen repair solution in improving immunohistochemical staining results of poorly pretreated tissues. Methods From March to May 2022， 68 postoperative pathological specimens were collected in Wenzhou Central Hospital， including 19 cases of breast cancer， 32 cases of bowel cancer and 17 cases of tonsil. Tissue wax blocks were made by simulating the tissue processing process with poor pretreatment， and of each antibody were made for each case. Two slices of each labeled antibody for each case were devided into control group （using ethylenediaminetetraacetic acid antigen repair solution） and experimental group （using itaconic anhydride antigen repair solution）， and compare the immunohistochemical staining results of the two groups. Results Four mmol/L itaconic anhydride was selected as the subsequent antigen repair solution. There was no significant difference in sensitivity between experimental group and control group （P>0.05）. The specific excellent and good rate of immunohistochemical staining results in experimental group was significantly higher than that in control group （92.48% vs. 76.69%， χ2=25.43， P<0.05）. The morphology of cells stained by immunohistochemistry in experimental group was significantly better than that in control group （χ2=13.60， P<0.01）. In control group， folds， local sheet loss， cell enlargement or even severe deformation， and unclear cell membrane/plasmic/nuclear localization were common， while in experimental group， folds were less， there was almost no sheet loss， cell morphology was relatively intact， and cell membrane/plasmic/nuclear localization was relatively clear. Conclusion When the tissue is not fixed in time or there is a problem in the dehydration process， it is recommended to use itaconic anhydride antigen repair solution to obtain the specific and better immunohistochemical staining results of cell morphology.

[Key words] Itaconic anhydride; Immunohistochemistry; Fixation; Non-specific binding

免疫组织化学（以下简称免疫组化）检测技术发展至今已有一个多世纪，技术十分成熟，但免疫组化染色问题却一直长期存在，主要原因是影响免疫组化染色结果的因素众多。其中影响较大的包括组织前处理、抗原修复条件、一抗及检测系统的敏感度和特异性、孵育时间和温度等[1]。在组织前处理良好的情况下，采用乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）抗原修复，染色结果良好，强度正常，背景清晰，细胞形态正常。当组织前处理不佳时，采用同样的组织类型、同样的抗原修复条件和染色条件进行操作，染色结果不佳，非特异性严重，组织切片出现皱褶、局部掉片、细胞变形、细胞膜/质/核定位或边界不清晰等现象。因此，本研究采用衣康酸酐配制的抗原修复液对前处理不佳的组织进行测试，尝试解决前处理不佳的组织出现非特异性及细胞形态破坏等问题。

1  材料和方法

1.1  材料

1.1.1  一般资料  前瞻性收集2022年3～5月温州市中心医院术后病理标本68例，其中乳腺癌19例，肠癌32例，扁桃体17例。每个病例在不影响病理诊断的前提下，额外多取材一块组织（大小2.0cm×1.5cm×0.8cm）作为研究对象。乳腺癌每例分别标记抗体HER2、CK、p53；肠癌每例分别标记抗体Ki-67、MSH2、MSH6、PMS2、MLH1、P-gp；扁桃体每例分别标记抗体Bcl-6。每个病例每种标记抗体切片2张，根据随机数字表法分为对照组（使用EDTA抗原修复液）和实验组（使用衣康酸酐抗原修复液）。本研究经温州市中心医院伦理委员会批准（伦理审批号：L2022-01-078）。

1.1.2  主要试剂  EDTA抗原修复液（pH 9.0）、过氧化物酶阻断剂、一抗、羊抗鼠/兔HRP标记IgG、DAB（福州迈新生物技术开发有限公司）；衣康酸酐（国药集团化学试剂有限公司）。

1.2  方法

1.2.1  模拟前处理不佳的组织固定和脱水流程  68例组织延迟24h固定，并降低第一道脱水酒精的浓度至40%，其余流程与正常组织前处理流程一致（梯度酒精脱水、二甲苯透明、浸蜡）。

1.2.2  免疫组化染色流程  组织切片经脱蜡、水化后，对照组和实验组均采用水煮锅于100℃维持20min。抗原修复后，滴加50μl过氧化物酶阻断剂室温孵育10min，磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）冲洗3min×2；滴加50μl一抗室温孵育60min，PBS冲洗3min×2；滴加50μl二抗室温孵育30min，PBS冲洗3min×2；滴加50μl DAB室温孵育5min，自来水冲洗，苏木素复染，中性树胶封片，镜检。两组除抗原修复液不同外，其他试剂及染色条件完全一致。

1.2.3  衣康酸酐最佳浓度测试  采用不同浓度（1mmol/L、2mmol/L、4mmol/L、8mmol/L、16mmol/L）的衣康酸酐配置抗原修复液，氢氧化钠调节抗原修复液pH至7.4±0.2。然后用正常前处理的病理组织蜡块，并选择对抗原修复要求较高的抗体作为测试一抗，EDTA作为对照，测试出最佳衣康酸酐抗原修复液的浓度。

1.2.4  免疫组化染色评判标准  免疫组化染色结果由2名高年资病理医生参考行业规范指南进行双盲独立判读。判定标准：表达的抗体敏感度根据细胞反应强度综合判定，深棕色为强阳性（+++），棕色为中度阳性（++），浅棕色为阳性（+），呈现很淡的棕色为弱阳性（±），没有颜色为阴性（－）；免疫组化特异性评分总分10分，>8分为优良（轻度背景扣1分，中度背景扣2～3分，重度背景扣4～5分，無法判读不得分）；细胞形态完整、细胞膜/质/核定位或边界清晰为细胞形态佳，细胞肿大变形、细胞膜/质/核定位或边界不清晰为细胞形态差[2-3]。

1.3  统计学方法

采用SPSS 20.0统计软件对数据进行分析处理。计数资料以例数（百分率）[n（%）]表示，比较采用χ2检验，等级资料比较采用秩和检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2  结果

2.1  衣康酸酐抗原修复液最佳浓度的选择

结果显示，1mmol/L和16mmol/L的衣康酸酐比其他浓度的衣康酸酐染色强度整体偏弱，2mmol/L、4mmol/L、8mmol/L的衣康酸酐整体染色结果稍弱于对照组，但三组染色结果整体无显著差异，见表1。部分抗体染色结果见图1。其中，部分较敏感的抗体，如Ki-67、PMS2、Bcl-6等，4mmol/L的衣康酸酐染色结果更佳。综合考虑，选择4mmol/L的衣康酸酐作为后续抗原修复液。

2.2  衣康酸酐抗原修复液对免疫组化敏感度的影响

采用4mmol/L的衣康酸酐抗原修复液对组织前处理不佳的组织进行测试，结果显示，两组的敏感度比较差异无统计学意义（P>0.05），见表2。

2.3  衣康酸酐抗原修复液对免疫组化特异性的影响

实验组免疫组化染色结果的特异性优良率显著高于对照组（92.48% vs. 76.69%，χ2=25.43，P<0.05），见表3、图2。其中，特异性差异最显著的是HER2和p53，由于该病例组织前处理较差，EDTA修复已严重影响诊断结果，无法判读。

2.4  衣康酸酐抗原修復液对细胞形态的影响

实验组免疫组化染色的细胞形态显著优于对照组（χ2=13.60，P<0.01），见表4。对照组普遍出现皱褶、局部掉片、细胞肿大甚至严重变形、细胞膜/质/核定位不清晰；而实验组皱褶较少，几乎无掉片现象，细胞形态相对完整，细胞膜/质/核定位相对清晰，见图3。

3  讨论

自1941年Coons采用荧光素标记抗体检测肺组织中肺炎双球菌取得成功以来，免疫组化技术得到快速发展，其主要用于病理诊断、鉴别诊断、判断疾病的预后和评估临床疗效[4]。随着个性化精准医疗的兴起，尤其在肿瘤治疗领域，通过免疫组化染色技术检测肿瘤病理标本中的特定分子，对分子靶标进行定位指导治疗更需要其结果的准确性和稳定性[5]。影响免疫组化染色结果的因素较多，其中影响较大的因素是抗原修复[6-7]。常用的抗原修复方式为热修复和酶修复。常用的抗原修复液有EDTA、柠檬酸、Tris、胰酶、胃酶等[8-9]。本研究选取EDTA热抗原修复液作为对照，EDTA是免疫组化中最常用、效果最佳的抗原修复液，具有抗原决定簇暴露充分、性价比高、染色结果强等优点[10-12]。

此外，试剂滴度、孵育时间、温度、特异性和敏感度等也可影响免疫组化染色结果，其中较易忽视的影响因素是组织前处理。临床医生对标本前处理的重视程度不够，术后未及时固定；医生取材的组织过大过厚及大标本未按要求剖开固定；病理技术人员对标本处理流程、更换脱水试剂的不规范等多种因素均会影响组织前处理效果[13-15]。从免疫组化角度看，固定不仅要凝固细胞内蛋白质以保持组织的固有形态和结构，而且要尽量减少酶反应以防细胞自溶导致抗原弥散至组织间质。组织固定不及时或脱水不彻底，组织细胞易出现自溶、破裂、褶皱等现象，免疫组化染色结果出现部分抗体非特异性及背景着色，严重时影响诊断结果[16-17]。

本研究模拟组织前处理不佳的流程，可见组织切片出现明显的褶皱和细胞自溶现象，部分抗体指标即使采用常规最优化的免疫组化染色流程仍出现明显非特异性和背景着色；而日常工作中固定及时的组织采用同样的染色流程背景干净，特异性好。另外，对固定不及时的病理标本采用衣康酸酐抗原修复液和EDTA抗原修复液进行对比发现，衣康酸酐可显著改善组织前处理不佳引起的皱褶、脱片、细胞形态破坏及非特异性和背景着色，且染色的敏感度未见明显下降。衣康酸酐分子中的碳–碳不饱和双键及酐基等活性官能团可作为良好的表面活性剂，主要作用是解除蛋白质之间的交联且有较好的通用性。前处理不佳的组织经衣康酸酐抗原修复液修复后，细胞自溶裂解物被消除或屏蔽，不易与一抗及二抗发生非特异性吸附，从而起到降低背景和非特异性染色的作用。衣康酸酐抗原修复液为弱碱性，与PBS的pH值一致，对细胞形态破坏比较少，但具体机制尚不明确，需进一步深入探讨研究。实验组的敏感度与对照组相比无统计学意义，但其特异性和细胞形态明显优于对照组。

综上，病理技术人员在临床工作中遇到部分组织固定不及时或脱水流程出现问题，建议使用衣康酸酐抗原修复液以获得特异性及细胞形态较好的免疫组化染色结果。

[参考文献][1] 王德田， 丁伟. 实用现代病理学技术[M]. 2版. 北京： 中国协和医科大学出版社， 2022.