犬细小病毒的分离鉴定研究

李凤艳，陈生雷，刘艳霞，王一平，王 博，舒秀伟

（ 辽宁益康生物股份有限公司，辽宁 辽阳 111000 ）

犬细小病毒病是由犬细小病毒（canine parvovirus，CPV）引起的一种以剧烈呕吐、出血性腹泻为主要特征的烈性传染病，多发于幼年犬，病程快、死亡率高，痊愈犬易患慢性胃肠道疾病，对犬科动物的健康造成严重威胁[1]。CPV 为细小病毒科、细小病毒属、无囊膜的单链DNA 病毒，基因组全长5.2 kb，编码2 种结构蛋白（VP1、VP2）和2种非结构蛋白（NS1、NS2）[2]。其中，VP2蛋白占病毒衣壳的90%，是最主要的保护性抗原，与病毒的致病性和毒力密切相关。CPV对外界的抵抗力很强，对乙醚、氯仿、醇类和去氧胆酸盐具有抵抗力，其感染性和血凝性均不受影响，对温度也具有一定耐受性[3]。自1977年CPV被发现以来，该病毒已在世界范围内广泛传播，并迅速出现新基因型毒株CPV-2a、CPV-2b和CPV-2c。新型毒株在致病力、宿主范围及流行区域等方面也与原毒株有所差异。目前从不同的国家和地区已分离到3 种亚型，其中CPV-2a 主要在印度、韩国和意大利流行，CPV-2b在越南、日本、美国和欧洲地区流行，CPV-2c 是乌拉圭、意大利的主要流行株。我国主要流行毒株为CPV-2a，南方部分地区以CPV-2b为主[4-6]。CPV变异株不断出现导致疫苗免疫失败时常发生，给该病防治带来了很大困难。预防犬细小病毒病主要的手段是注射犬细小病毒病疫苗，目前国内拥有的CPV弱毒株大多为国外引进。本研究采集一表现轻微肠炎症状病犬的病料，在F81细胞上分离出一株中等毒力的CPV毒株，并对该分离毒株进行生物学特性研究，以期为后续开展新型CPV疫苗的研制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 病料

试验于辽宁省某犬场采集出现临床犬细小病毒病疑似症状（发热、精神沉郁、轻度腹泻症状）的幼犬1例。

1.1.2 细胞

F81细胞购自中国兽医药品监察所。

1.1.3 试剂

RPMI Medium 1640、胎牛血清（GIBCO 公司）；Easy Pure Viral DNA/RNA Kit、EasyScript One-Step RT-PCR Super Mix（北京全式金生物技术有限公司）；抗血清由军事兽医研究所提供。

引物（F：5'-CTCAGCCACCAACTAAAG-3'，R：5'-GTAAGCCCAATGCTCTAT-3'）由宝生物（大连）有限公司合成。

1.2 试验方法

1.2.1 病料组织采集及处理

采集CPV病犬肠管l g，按1∶10加入灭菌冷生理盐水，放入组织搅拌机中，10 000~12 000 r/min充分捣碎组织，充分捣碎组织，反复在-70 ℃以下冻融3次，用3层灭菌纱布过滤2次，收集滤液，并以12 000 r/min、4 ℃离心30 min，收集上清，加入终浓度为1 000 IU/mL 青霉素、1 000 mg/L 链霉素，分装，-80 ℃贮存。

1.2.2 分子生物学鉴定和核苷酸序列分析

利用犬细小病毒VP2基因的特异性引物，采用常规方法对采集的病毒进行PCR鉴定，并将扩增产物送至宝生物（大连）有限公司进行测序，选取GenBank上登录的CPV参考序列（见表1），使用DNAStar 生物软件进行核苷酸同源性分析和进化树构建。

表1 参考毒株信息Tab.1 Information of reference strains

1.2.3 病毒分离

采用F81 细胞，按常规方法消化培养，待传代分散细胞时同步接入上述处理的病料，同时设不接毒的健康细胞对照。置于37 ℃含5% CO2培养箱培养观察3~5 d，收获培养物进行鉴定。

1.2.4 病毒含量测定

将毒种用含8%新生牛血清的RPMI Medium 1640 细胞培养液作10 倍系列稀释，取10-1~10-8稀释度，分别同步接种96 孔F81 细胞培养板，每个稀释度接种8 孔，每孔0.1 mL，同时设正常细胞对照8 孔，置于37 ℃、含5% CO2培养箱培养观察5 d，根据Reed-Muench 法计算细胞半数感染量（TCID50）。

1.2.5 病毒鉴定

用F81 细胞培养的病毒上清采用常规的磷钨酸染色后作负染，进行电镜观察。

1.2.6 病毒特异性鉴定

分别采用0.1 mL CPV 阳性血清、犬瘟热病毒（CDV）阳性血清、犬腺病毒（CAV）阳性血清、狂犬病病毒（RV）阳性血清和健康犬阴性血清与病毒分离物0.1 mL在37 ℃中和1 h，同步接种F81细胞。同时设病毒对照和正常细胞对照各6孔，置于37 ℃、含5% CO2培养箱中培养观察5 d。

1.2.7 病毒回归试验

取2~3 月龄CPV 抗体阴性（SN<1:2）的健康幼犬4 只，将病毒培养液稀释为105.0TCID50/mL，通过口服途径各接种2.0 mL/d，隔离饲养观察14 d，同时设置4只不接种对照犬，分别记录每组犬的临床表现。

2 结果与分析

2.1 分子生物学鉴定

2.1.1 PCR扩增结果（见图1）

图1 PCR扩增结果Fig.1 PCR amplification results

根据临床症状，初步诊断病犬为CPV感染。

由图1 可知，利用CPVVP2 基因的特异性引物，通过PCR 扩增，产物经1%琼脂糖凝胶电泳得到390 bp 的特异性的核酸片段，与预期片段大小相符，命名为CPV P6株。

2.1.2 病毒核苷酸序列测定和遗传演化分析（见图2~图4）

图2 核苷酸序列测定结果Fig.2 Nucleotide sequence determination result

利用CPVVP2 基因特异性引物扩增后核苷酸序列测定结果见图2。

由图3、图4 可知，通过生物学软件DNAstar 进行核苷酸同源性比较和遗传进化分析，结果表明，分离株与GenBank 上登录的国内外已发表CPV 参考序列的核苷酸序列同源性最高达99.4%。由遗传进化树可知，分离株与2009 年中国分离株GU452715 亲缘关系较近，处于同一分支，属于Subgroup I 亚群，为国内分离株，基因型为CPV-2a。

图3 分离株与其他毒株同源性比较Fig.3 Homology comparison between the isolate and other strains

图4 分离株VP2基因遗传演化树Fig.4 Genetic evolutionary tree of VP2 gene of isolate

2.2 病毒分离结果（见图5）

图5 病毒分离结果Fig.5 Result of virus isolation

采用F81 细胞同步接种CPV 阳性病料的悬液后，第1 代细胞即出现了拉网和脱落的细胞病变（CPE），在此基础上进一步扩大2代，共培养收集病毒液200 mL。

2.3 病毒含量测定结果（见表2）

表2 病毒含量测定结果Tab.2 Determination result of virus content

由表2可知，第3代分离株病毒经病毒含量测定，根据Reed-Muench法计算TCID50，结果显示分离株对细胞的半数感染量为105.2TCID50/0.1 mL。

2.4 病毒形态观察结果（见图6）

图6 病毒形态观察结果Fig.6 Observation results of virus morphology

由图6 可知，电镜观察可见圆形、无囊膜、直径约20 nm的典型病毒粒子。

2.5 病毒特异性鉴定（见表3）

表3 病毒特异性鉴定结果Tab.3 Result of virus specificity identification

由表3可知，CDV抗血清、CAV抗血清、RV抗血清、阴性血清中和孔和病毒对照孔细胞均出现了拉网、破碎、脱落，CPV 抗血清中和组未出现CPE。结果表明，所分离的病毒为CPV。

2.6 动物回归试验

回归试验结果显示，观察至第5、6 d 时，3 只接种犬先后出现轻微肠炎，并伴有发热症状，病程持续5 d 后康复，对照组4只犬均未发病。

3 讨论

CPV属于细小病毒科细小病毒属成员，犬细小病毒病临床可分为肠炎型和心肌炎型。肠炎型自然感染的潜伏期为7~14 d，病初表现发热、体温可达40 ℃以上，精神沉郁、不食、呕吐，初期呕吐物为食物，之后为黏液状的黄绿色液体；发病1 d 后开始腹泻，病初粪便为稀粥状，随病程发展粪便呈咖啡色或番茄酱色，腥臭，排便次数不定；病犬可表现眼球下陷，鼻镜干燥，全身无力，体重明显下降，同时可见眼结膜苍白，严重贫血，若不及时治疗可造成肠内容物毒素吸收导致中毒，出现休克甚至死亡。

CPV在世界范围内广泛传播，不断有新的变异株被发现，目前我国流行多种亚型的CPV 毒株[7-10]。本研究从辽宁地区腹泻病犬肠管中分离到一株CPV，通过分子生物学鉴定、病毒分离、电镜观察、病毒特异性鉴定和动物回归试验等对分离毒株的生物学特性及致病力进行研究，发现该毒株为CPV-2a亚型[11-15]。该分离毒株与2009年中国分离株GU452715具有较高的同源性，且亲缘关系最近，处于同一分支，提示该基因型仍为辽宁地区的流行毒株。此外，该分离株与源自日本的AB115504、泰国的GQ379042、意大利的FJ222821等不同CPV亚型毒株在遗传距离上亲缘关系较远，推测导致不同流行毒株之间差异的重要原因可能与区域环境适应有关。

本研究丰富了我国犬细小病毒病流行病学调查资料及毒种资源，有助于了解本地区CPV 的遗传变异规律，为后续开展新型CPV疫苗的研制奠定了基础。

4 结论

本研究成功分离到1 株CPV，分离株与GenBank 上登录的国内外已发表CPV 参考序列的核苷酸序列同源性最高达99.4%。由遗传进化树可知，分离株与2009年中国分离株GU452715 亲缘关系较近，处于同一分支，属于Subgroup I 亚群，为国内分离株，基因型为CPV-2a。该分离株可在F81 细胞上连续传代，动物回归试验结果表明，该毒株为中等毒力毒株。