血管活性肠多肽对老龄勃起功能障碍大鼠的作用及机制研究

张存明 王军卫 陈 松 吴忠标 叶海波

勃起功能障碍（erectile dysfunction，ED）是指持续或反复出现的无法达到和/或维持阴茎勃起完成性活动，而年龄是ED 最为重要的发病原因之一，ED发病率随着年龄增长而升高[1]。ED 是最常见的男性性功能障碍，40～69 岁的男性患病率为61%，而70岁以上男性患病率则高达77%[2]。血管活性肠多肽（vasoactive intestinal polypeptide，VIP）是非肾上腺素能非胆碱能抑制性神经的重要递质，具有扩张血管、松弛平滑肌、抗炎等作用。前期研究表明，VIP 可以改善性腺功能障碍大鼠的勃起功能[3]。本研究通过延长饲养时间并进行勃起功能测试，构建老龄模型ED 大鼠，探讨VIP 对老龄模型ED 大鼠的治疗作用及其机制。

1 实验材料

1.1 动 物 SPF 级雄性SD 大鼠40 只，6 月龄，体质量300～320 g。购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，动物生产许可证号：SCXK（沪）2019-0005，饲养于浙江中医药大学动物实验中心，实验动物使用许可证SYXK（浙）2019-0098。本实验经浙江中医药大学动物管理与伦理委员会审核通过。动物饲养：温度（20±2）℃，湿度55%，照明/黑夜：12 h/12 h，自由饮食、饮水的环境。

1.2 药品和试剂 阿扑吗啡（B6936，批号ZJK-0921）购自ApexBio Technology；BCA 蛋白浓度测定试剂盒（P0012S，批号198273）、极超敏ECL 化学发光试剂盒（P0018FS，批号238924）、RIPA 裂解液（P0013K，批号938475）购自上海碧云天生物公司；环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）（H164，批号KD-3944）、一氧化氮（NO）酶联免疫吸附试验（ELISA）检测试剂盒（A012-1-2，批号20219434），均购自南京建成生物有限公司；VIP 购自Sigma 公司（V0131，批号SE-62344）；蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）（ab75991，批号D-1892）、内皮源性一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）（ab300071，批号D-8823）、血管性血友病因子（von willebrand factor，vWF）（ab6994，批号D90287）、血管内皮生长因子（VEGF）（ab214424，批号D0938），均购自英国Abcam 公司；HRP 羊抗鼠二抗（RS0002，批号R2903-2）、β-actin 兔抗大鼠单克隆抗体（YM3028，批号KL20384-8），购自北京Immunoway 公司。

1.3 仪 器 信息化生物信号采集与处理仪器（泰盟BL-420N），Olympus 正置图文采集系统显微镜（BX53M），微量高速冷冻离心机（M1324R），蛋白垂直电泳仪及转膜仪（美国Bio-Rad 公司），Fluor chem R 成像仪（Protein Simple 公司），脱水机、组织蜡块切片机（美国Thermo Scientific 公司，HM340E）。

2 实验方法

2.1 模型建立及分组处理 将40 只SD 大鼠饲养至18 个月龄，使用阿扑吗啡进行勃起诱导实验，阴茎头充血及末端阴茎出现记为1 次勃起，勃起次数≥1 次为阳性，勃起次数为0 分为ED 大鼠[4]。将筛选出的21 只大鼠按照随机数字表法分为老龄勃起功能正常大鼠组（正常组）、老龄ED 大鼠组（ED 组）和老龄ED 大鼠药物干预组（干预组），干预组大鼠使用VIP 25 ng/kg 隔日腹腔注射，治疗28 d[5]。

2.2 海绵体内压及平均动脉压（mean arterial pressure，MAP）测定 所有大鼠用戊巴比妥钠（40 mg/kg）麻醉后沿腹正中线切口切开，使用显微器械暴露走形往阴茎方向的腹侧海绵体神经进行电刺激，电刺激参数设定为：频率20 Hz，宽度5 ms，电压5 v，持续60 s，间隔休息时间5 min。同时将连接生理信号采集处理系统的22 号紫色输液针置入阴茎海绵体内，暴露同侧颈动脉置入PE-50 管以监测MAP[6]。

2.3 组织免疫荧光染色法检测大鼠阴茎海绵体vWF 表达 机能实验结束后获取的阴茎海绵体组织用4%多聚甲醛固定过夜，石蜡包埋后切成5 μm 切片，脱蜡及乙醇脱水，枸橼酸钠进行抗原修复后使用10%山羊血清37%湿盒内封闭30 min，一抗4 ℃孵育过夜，二抗在37 ℃避光孵育1 h，加入DAPI 染色液室温避光孵育10 min。防荧光淬灭封片剂封片后使用荧光显微镜观察并记录。

2.4 ELISA 法检测海绵体组织cAMP 和NO 含量大鼠阴茎组织获取后置于-80 ℃冰箱备用，临用时在组织中加入9 倍体积的磷酸盐缓冲溶液，匀浆后5000 r/min 离心15 min，获取的上清液按试剂盒说明书操作，测定cAMP 和NO 含量。

2.5 蛋白印迹法检测阴茎海绵体组织PKA、eNOS、vWF 及VEGF 蛋白表达 大鼠阴茎海绵体组织粉碎后加入蛋白裂解试剂提取组织总蛋白，使用BCA 试剂进行蛋白定量后将样品与5×蛋白上样缓冲液按4∶1 在冰上配置混合液体混匀后于100 ℃水浴锅中煮沸10 min，冷却后置于-20 ℃冰箱保存备用。后续实验室时将等量蛋白加入聚丙烯酰胺凝胶上样孔内，以110 V 的恒压电泳，当溴酚蓝进入底部后进行转膜操作，以300 mA 电流转膜80 min 至聚偏二氟乙烯（PVDF）印迹膜。PVDF 膜5%脱脂牛奶封闭1 h，一抗（PKA、eNOS、vWF、VEGF、β-actin 1∶1000）4 ℃孵育过夜，相应二抗室温下摇床孵育2 h 后使用ECL发光液，使用Image J 分析条带灰度值，以β-actin作为内参，分析各目的蛋白相对表达水平。

2.6 统计学方法 应用SPSS 22.0 软件分析所得数据，符合正态分布的计量资料以均数±标准差（）表示，方差齐的数据使用单因素方差分析（one-way ANVOVA），P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 各组老龄大鼠勃起功能比较 正常组、ED 组及干预组大鼠各组间基础ICP、MAP 比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。与正常组比较，ED 组Max ICP 与Max ICP/MAP 明显降低（P＜0.01）；与ED 组比较，干预组Max ICP、Max ICP/MAP 增高（P＜0.05 或P＜0.01）。见表1。

表1 各组老龄大鼠勃起功能比较（）

表1 各组老龄大鼠勃起功能比较（）

注：正常组为老龄勃起功能正常大鼠；ED 组为老龄勃起功能障碍大鼠；干预组为老龄勃起功能障碍大鼠使用血管活性肠多肽腹腔注射；Base ICP 为基础阴茎海绵体内压；Max ICP 为阴茎海绵体内压最大值；MAP 为平均动脉压；1 mmHg=0.133 kPa；与正常组比较，aP＜0.01；与ED 组比较，bP＜0.05，cP＜0.01

3.2 各组小鼠阴茎海绵体组织vWF 表达比较 免疫荧光结果显示，正常组红色荧光表达明亮，ED 组与正常组比较，红色荧光明显减弱。干预组与ED 组比较，红色荧光明显增加。同时ED 组中，海绵窦充血间隙空间减少，而VIP 治疗后间隙增加，见图1。

图1 荧光显微镜观察各组大鼠阴茎海绵体组织vWF 蛋白荧光强度表达（×100）

3.3 各组大鼠阴茎海绵体组织cAMP 和NO 表达量比较 与正常组比较，ED 组大鼠阴茎海绵体组织上清液cAMP 与NO 含量降低（P 均＜0.05）。与ED 组比较，干预组cAMP 明显升高（P＜0.01），同时NO 升高（P＜0.05）。见表2。

表2 各组大鼠阴茎海绵体cAMP 和NO 表达水平比较（）

表2 各组大鼠阴茎海绵体cAMP 和NO 表达水平比较（）

注：正常组为老龄勃起功能正常大鼠；ED 组为老龄ED 大鼠；干预组为老龄ED 大鼠使用血管活性肠多肽腹腔注射；cAMP 为环磷酸腺苷；NO 为一氧化氮；ED 为勃起功能障碍；与正常组比较，aP＜0.01；与ED 组比较，bP＜0.05，cP＜0.01

3.4 各组大鼠阴茎海绵体组织PKA、eNOS、vWF 及VEGF 蛋白表达比较 与正常组比较，ED 组PKA、vWF 及VEGF 蛋白表达量显著降低（P＜0.01）；eNOS蛋白表达降低（P＜0.05）。与ED 组比较，干预组PKA、eNOS、VEGF 蛋白表达增加（P＜0.05）；vWF 蛋白表达显著升高（P＜0.01）。见图2 和表3。

图2 各组大鼠阴茎海绵体组织PKA、eNOS、vWF、VEGF 表达注：正常组为老龄勃起功能正常；ED 组为老龄ED 大鼠；干预组为老龄ED 大鼠使用血管活性肠多肽腹腔注射

表3 各组大鼠阴茎海绵体PKA、eNOS、vWF、VEGF 蛋白表达水平比较（）

表3 各组大鼠阴茎海绵体PKA、eNOS、vWF、VEGF 蛋白表达水平比较（）

注：正常组为老龄勃起功能正常大鼠；ED 组为老龄ED 大鼠；干预组为老龄ED 大鼠使用血管活性肠多肽腹腔注射；PKA 为蛋白激酶A；eNOS 为内皮源性一氧化氮合酶；vWF 为血管性血友病因子；VEGF 为血管内皮生长因子；β-actin 为β-肌动蛋白；ED 为勃起功能障碍；与正常组比较，aP＜0.05，bP＜0.01；与ED 组比较，cP＜0.05，dP＜0.01

4 讨论

衰老所致的阴茎海绵体内皮细胞损伤是导致ED 的主要病因之一，血管新生能力减弱伴随者内皮细胞的功能及数量降低，导致eNOS 表达减弱，从而导致NO 生成不足，平滑肌舒张能力减弱诱发ED[7-8]。VIP 勃起神经递质通过与阴茎海绵体平滑肌细胞膜上的G-蛋白偶联受体结合，活化腺苷酸环化酶后使三磷酸腺苷转化为cAMP，特异性激活PKA 后阴茎充血勃起。近年来研究表明，VIP 在大鼠阴茎海绵体的表达与大鼠年龄差异无关[9]，并且能够通过非雄激素依赖的通路参与海绵体平滑肌松弛与勃起[3]，男性ED 患者阴茎海绵体注射VIP 联合酚妥拉明能够显著改善ED[10]，但是其治疗机制尚未明确。

ICP 检测结果表明，对老龄ED 大鼠腹腔注射VIP 后大鼠阴茎海绵体内压增高，表明血管扩张后流入阴茎海绵体内的充血量及压力增加，侧面反映出大鼠勃起功能障碍得到改善。阴茎内皮细胞功能减退影响血管张力，vWF 主要来源于内皮细胞，是其重要的生物标志物。本研究结果表明，VIP 干预后vWF的荧光强度及海绵窦间隙明显增加，表明VIP 干预后阴茎海绵体内皮细胞数量显著增加。阴茎海绵体内VEGF 蛋白表达随着机体衰老而减少，而VEGF作为一种强效血管生成因子与通透因子，其与血管的生成密切相关。此外动物研究证据表明，VEGF 不仅可以促进内皮细胞的生成，同时能够激活eNOS 生成NO[11]，因此VEGF 调控的血管生成是改善老龄ED 的重要机制。VIP 腹腔注射能够促进老年ED 阴茎海绵体内VEGF 的表达，荧光结果显示vWF 增加，提示应用VIP 后阴茎海绵体内血管再生的同时伴随着内皮细胞的增生。

老年ED 大鼠海绵体内皮细胞减少后eNOS 蛋白表达量亦明显降低，当VIP 治疗后eNOS 蛋白表达量增加，同时cAMP 与NO 的表达增加。因此，VIP可能通过VEGF 促进大鼠阴茎海绵体血管以及内皮细胞的生成，而内皮细胞来源的eNOS 生成的NO 增加是导致阴茎海绵体内灌注及海绵体内压恢复的重要机制。VIP 能够激活cAMP/PKA 信号通路促进VEGF 介导的内皮细胞增殖，从而促进局灶性脑缺血的血管生成[12]。本研究中老龄ED 大鼠阴茎海绵体低表达的cAMP 与PKA 被VIP 逆转，因此VIP 能调节大鼠阴茎海绵体cAMP/PKA 信号通路从而促进VEGF 表达以及海绵体内血管增生，促进eNOS 表达释放NO 进而修复勃起功能。

综上所述，VIP 能够有效改善老龄大鼠的勃起功能，其作用机制可能通过调控cAMP/PKA 通路以及改善阴茎海绵体内皮功能有关。