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脂质体递药系统的靶向修饰*

2023-06-20崔韶晖陈星妍张树彪

生物化学与生物物理进展 2023年6期
关键词:脂质体多肽靶向

杜 桑 崔韶晖 陈星妍 张树彪

(大连民族大学生命科学学院,生物技术与资源利用教育部重点实验室,大连 116600)

脂质体(liposomes,LPs)是由脂质双层膜构成的中空小球,在水相中,脂质分子通常会自发聚集,以疏水尾部“尾对尾”、亲水头部“肩并肩”的形式形成一个双层的中空囊泡,其中空的部分可以装载亲水性的药物[1],同时,其脂双层之间又可以装载亲脂性药物。由于LPs的这种特点,被认为是一种良好的药物载体。此外,LPs还有许多其他优点,如粒径可调控、稳定性较好、具有缓释作用、毒性低、生物相容性好、无免疫原性、造价低等[2]。LPs作为药物载体,能够很好地保护药物免受外部介质的伤害,可以减少药物所引起的副作用,但是由于缺乏肿瘤靶向性,使得LPs药物难以达到良好的治疗效果。为了克服该缺点,研究者们开发出多种靶向修饰LPs。肿瘤细胞会高表达一些受体,靶向LPs就是在LPs表面插入可以与肿瘤细胞表面受体识别的修饰物,利用修饰物与受体的特异性识别与结合作用,将LPs携带的药物递送进肿瘤细胞,进而达到治疗肿瘤的目的[3]。根据靶向修饰物的类型不同,可分为多肽类、抗体类、糖类、配体类、核酸适配体类5个主要类型(图1)。本文依据这5类,就近几年来国内外有关靶向修饰LPs递药系统的研究进展进行综述。

Fig. 1 Schematic diagram of the main types of targeting modified liposomes图1 靶向修饰脂质体主要类型的示意图

1 多肽修饰的脂质体

多肽分子是机体内一类重要的生物活性物质,参与机体的生长发育以及代谢,同时也是蛋白质水解的中间产物。多肽具有高特异性、高选择性、尺寸小、易修饰和高生物相容性等优点,此外,由于没有三级结构,多肽通常会更加稳定,因此,多肽在靶向给药方面具有非常广阔的应用前景[4]。按照多肽功能可大致分为靶向细胞多肽、细胞穿膜肽和靶向细胞穿膜肽三类[5]。

1.1 靶向细胞多肽修饰的脂质体

靶向细胞多肽(homing peptide,HP)也称归巢肽,是一类与肿瘤细胞或肿瘤微环境因子结合的特异性多肽[4]。HP已被广泛应用于药物递送领域,其中以精氨酸(R)-甘氨酸(G)-天冬氨酸(D)三肽(RGD)组成的靶向活性肽最为典型。RGD能与整合素受体(αvβ3、αvβ5和αvβ1)选择性结合,进而促使RGD 修饰的LPs 与细胞外基质和细胞膜发生相互作用。此外,有研究表明,相比于线状的RGD肽,环状的RGD 肽(cyclic RGD、cRGD)与整合素结合的效果更好[6-7]。

Fu等[6]用自主合成的三肽头部的类脂N,N-双十四烷氧酰胺乙基三聚鸟氨酸酰胺(CDO14)和二油酰磷脂酰乙醇胺(dioleoylphosphatidylethanolamine,DOPE)为基础,制备了cRGD 修饰的LPs(cRGD/CD),同时搭载阿霉素(doxorubicin,DOX)用以靶向治疗肺癌(图2)。cRGD/CD-DOX的细胞摄入率更高,因为cRGD能实现肺癌细胞靶向性,同时CDO14 脂质体具有酸不稳定性,即在溶酶体的酸性环境下,能够解组装,并实现溶酶体逃逸,从而释放DOX以达到杀死肿瘤细胞的目的。体内外研究结果均表明,相比于对照组,cRGD/CD-DOX有更强的抗肿瘤活性。

Fig. 2 Schematic diagram of cRGD modified liposomes targeting tumors[6]图2 cRGD修饰的脂质体靶向肿瘤示意图[6]

由天冬酰胺(N)-甘氨酸(G)-精氨酸(R)组成的三肽NGR 可以与肿瘤细胞膜上的氨基肽酶N(aminopeptidase N,CD13)特异性结合,因此也被用于LPs靶向修饰[8]。Gu等[9]将NGR肽插入到包载紫杉醇(paclitaxel,PTX)的pH 敏感LPs 表面,以CD13 高表达的人纤维肉瘤细胞HT-1080 为实验对象,实验结果证实,NGR 肽修饰的LPs 能特异性靶向HT-1080细胞,并显著提高LPs的抗肿瘤活性。

HP 通过与细胞表面的受体结合,能有效将其修饰的LPs 携带进入肿瘤细胞,显示出HP 修饰的LPs 在肿瘤治疗中具有巨大潜力。然而,目前HP修饰LPs的应用仍然受到限制,其中关键的问题在于这些多肽的受体主要存在于肿瘤血管内皮细胞,并不具有肿瘤治疗的普适性。因此,提高对HP普适性筛选的研究十分重要。

1.2 细胞穿透肽修饰的脂质体

细胞穿透肽(cell-penetrating peptide,CPP)是一类体积小、氨基酸序列短的多肽序列。其与脂质双层具有高亲和力,当CPP 与细胞膜结合时,这些多肽序列能够负责膜转位,进而使CPP 内化进入细胞内[10]。CPP具有将药物载体快速、高效、无毒地输送到细胞中的巨大前景,为解决因进入细胞受阻的治疗方式提供了新方向[11]。

反 式 激 活 转 录 蛋 白 (transactivative transcription protein,TAT)是从人类免疫缺陷病毒中发现的一个富含精氨酸序列的多肽,具有CPP的 性 质。Kuai 等[12]设 计 了 一 种 由 聚 乙 二 醇(polyethylene glycol,PEG) 和TAT 修 饰 的 可 控LPs。其中PEG 由二硫键连接,可以保护性遮挡TAT,当添加完全裂解剂L-半胱氨酸(L-Cys)时可以断裂二硫键,释放PEG 的空间位阻,从而暴露“功能分子”TAT,TAT 可以提高LPs 的细胞摄取,进而实现细胞对LPs摄入的控制。由于CPP本身缺乏靶向性,单独修饰CPP的LPs往往无法实现靶向肿瘤目的,为了解决这个问题,Shi 等[13]设计了一种同时具有主动靶向整合素αvβ3和细胞穿膜功能的多肽,它是由cRGD 和CPP 组成的串联肽。研究结果显示,该串联肽修饰的紫杉醇LPs对荷瘤小鼠的抑瘤率达到85.04%,且小鼠的存活率明显高于其他各对照组。

CPP具有很强的细胞穿透能力。用CPP修饰载药的LPs能有效提高细胞摄入率,但是由于CPP不能特异识别肿瘤组织细胞,可能存在对正常组织细胞产生伤害的风险。因此,往往需要对CPP 进行进一步的设计或是同时联合靶向基团共修饰LPs,以达到既增强靶向作用又能提高癌细胞摄入率的目的。

1.3 靶向细胞穿膜肽修饰的脂质体

靶向细胞穿膜肽(cell-penetrating homing peptides, CPHPs)同时拥有细胞靶向和细胞穿膜的功能。Sugahara 等[14]筛选出一种靶向细胞穿膜肽(internalizing RGD,iRGD),iRGD 是指内化RGD,其氨基酸序列为CRGDKGPDC,能主动靶向识别高表达整合素αvβ3受体的肿瘤细胞,且具有穿膜作用。iRGD 遵循多步肿瘤靶向机制,首先完整的肽结合到表达整合素αvβ3受体的细胞表面,随后被蛋白质水解,产生CRGDK 片段,CRGDK 片段对整合素αvβ3受体亲和力较低而对神经黏连蛋白1 亲和力较高,促使CRGDK 从整合素αvβ3受体转移到神经黏连蛋白1,由此产生了穿膜活性[14]。

Deng 等[15]制备了iRGD 修饰的包载DOX 的LPs(iRGD-LTSL-DOX)。该LPs 利用iRGD 的靶向性和细胞穿透性,将药物载体带入肿瘤细胞,释放DOX 以达到杀伤肿瘤细胞的作用。体外实验比较了对αvβ3表达程度不同的细胞靶向能力,结果显示,iRGD-LTSL-DOX 在高表达αvβ3的细胞中,其靶向能力是LTSL-DOX 的1.8~2 倍。该结果表明,iRGD 修饰的LPs 能有效靶向到肿瘤细胞中并实现肿瘤细胞的杀伤作用。Yu 等[16]利用修饰有iRGD的空间稳定性LPs(iRGD-SSL-DOX)进行黑色素瘤的治疗。黑色素瘤细胞B16-F10过表达αv整合素受体,能识别iRGD 修饰的LPs。体外以及体内实验结果表明,iRGD 修饰的LPs 具有更高的肿瘤靶向性和肿瘤穿透活性。体内抗肿瘤结果表明,iRGD-SSL-DOX对B16-F10荷瘤小鼠的抗黑色素瘤作用强于SSL-DOX。

利用多肽修饰LPs将药物输送到癌细胞的研究越来越受关注,体内外的研究也都显示着良好的结果[17]。多肽修饰的LPs 可以增加所携带药物在肿瘤细胞中的富集,提高肿瘤治疗的效果,显示出其良好的研究价值和应用前景。但是由于多肽自身存在一些限制因素,如缺乏靶向性、靶向普适性等。因此,如何解决多肽存在的限制因素是未来研究的重要关键。

2 抗体修饰的脂质体

抗 体 修 饰 的 LPs 即 免 疫 脂 质 体(immunoliposomes,IL),是将单抗或抗体功能化片段插入LPs表面,借助抗体与靶细胞表面抗原特异性结合,从而使LPs递药系统富集于靶细胞,减少药物副作用[18]。IL 依据靶头抗体可分类为完整抗体、单克隆抗体、抗体Fab 片段和单链抗体(single chain fragment variable,scFv)[18-19]。其中完整抗体由于体积过于巨大,不利于LPs的体内循环,且专一性不强,所以目前很少使用完整抗体作为修饰体。

2.1 单克隆抗体修饰的脂质体

利用杂交瘤技术将骨髓瘤细胞和可分泌抗体的B淋巴细胞融合,再经过筛选和克隆化得到大量单克隆细胞株,该细胞株产生的高度均一、仅针对某一特定抗原的抗体即为单克隆抗体。单克隆抗体具有灵敏度高、特异性强、交叉反应少的优点。

Petrilli 等[20]将西妥昔单抗与荷载5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)的LPs 连接,制备成装载5-FU 的IL, 用于靶向表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptors,EGFR)高表达的鳞状细胞癌细胞SCC。通过IL与普通LPs对比研究发现,SCC 细胞对西妥昔单抗修饰的IL 的摄取是非修饰LPs 的3.5 倍。在体内,皮下注射IL 与阴性对照相比,肿瘤体积减少了60%以上;与游离5-FU 溶液和对照LPs 治疗相比,肿瘤体积减少约50%。Survivin 抑制剂YM155[21]是一种有前途的治疗神经细胞瘤的药物,但其利用率低限制了其使用。Gholizadeh 等[21]利用二棕榈酰磷脂酰胆碱(1,2-dihexadecanoyl-rac-glycero-3-phosphocholine,DPPC)为脂质载体装载YM155,同时修饰上抗二唾 液 酸 神 经 节 苷 脂 (monoclonal antidisialoganglioside,GD2)单克隆抗体,使LPs具有特异性识别成神经肿瘤细胞的功能。细胞实验结果表明,GD2修饰的LPs与成神经细胞瘤细胞的结合能力增加了4 倍,并且,由于LPs 的保护,使得YM155 在血浆中维持较高的水平,能有效杀伤神经瘤细胞。

单克隆抗体在靶向修饰药物载体研究方面具有较好的应用前景,利用其专一性与抗原结合的特点,可以精准地将药物载体带入到靶细胞内。但单克隆抗体的制备对于技术有一定的要求,这限制了其大规模的应用。此外,对于单克隆抗体自身所带来的细胞毒性也还缺乏较为深入的研究。

2.2 抗体Fab片段修饰的脂质体

抗体Fab片段是抗体在蛋白水解酶的作用下切割而来,由重链可变区、重链恒定区、轻链可变区、轻链恒定区以及一个二硫键组成[18,22]。Fab片段的尺寸较小,相比于整个抗体,其拥有更高的表面密度,更多的单位面积上可结合部位数量,以及优秀的组织穿透能力[23]。

Khan等[24]制备了可以靶向治疗人表皮生长因子受体2(human EGFR 2,HER2)过表达的乳腺癌IL。LPs 表面插入HER2 抗体的Fab 片段,同时装载脂肪酸合成酶(fatty acid synthase,FASN)的siRNA用于抑制乳腺癌细胞的增殖。对HER2过表达的乳腺癌SK-BR3细胞进行治疗,结果显示,制备的FASN-siRNA 修饰的LPs 都表现出明显更高的细胞摄取和内化效率,细胞的存活率降至20%,而对于HER-2 低表达的乳腺癌MCF-7 细胞,其存活率则降至36%。该结果显示出抗体Fab片段修饰的LPs 具有良好的肿瘤靶向能力。同样针对乳腺癌,Li 等[25]制备了修饰有ErbB2 抗体Fab 片段的LPs,可以通过乳腺癌细胞上的ErbB2 受体达到靶向目的,得到较好的治疗效果。

抗体Fab片段体积小、穿透力高,且由于没有Fc 片段,不会受到巨噬细胞和B 细胞等免疫细胞上Fc 受体的影响,能躲避机体的免疫监控,将所携带的药物载体运送至靶细胞。当然,由于没有Fc 片段,抗体Fab 片段的降解速度也会加快,因此,如何提高抗体Fab片段的稳定性,减缓其在体内的降解速度将是抗体Fab片段使用的一个亟需解决的问题。

2.3 单链抗体修饰的脂质体

scFv是由抗体重链高变区和轻链高变区两部分通过一个短肽连接而成的抗体,scFv含有完整的抗原结合位点,是具有抗体活性的最小功能结构单位,因其结构稳定、穿透能力强并且制备成本低而成为目前最先进的IL靶头抗体形式[26]。

头颈部鳞状细胞癌(squamous cell carcinoma of head and neck,SCCHN)是世界第5 大常见癌症,由于该区域的解剖学复杂性,完全手术切除几乎是不可能的。Wang 等[27]制备了一种可以靶向SCCHN 的IL,该LPs 利用抗EGFR 人源scFv 作为靶向修饰物,包载DOX 用以杀伤肿瘤细胞。体外的实验结果显示,相比于非靶向LPs,IL 增强了SCCHN 细胞的内吞作用,并显著降低药物递送载体的半数抑制浓度(IC50)。小鼠实验结果显示,利用IL 治疗的小鼠中位存活时间显著延长,且没有明显的全身毒性增加。Saeed 等[28]利用黑色素瘤抗原A1 的T 细胞受体样抗体的scFv 片段,修饰包载DOX 的LPs 用于靶向治疗黑色素瘤,通过对比非靶向LPs,黑色素瘤细胞在体外对IL的结合和内化更明显。细胞毒性结果显示,虽然非靶向LPs和靶向LPs体内药代动力学相似,但是靶向LPs的蓄积量要明显高于非靶向LPs,抗肿瘤活性也更优于非靶向LPs。

上述研究将抗体与LPs结合,利用抗体与抗原具有强专一性,设计出针对肿瘤治疗的IL,既能减少药物的副作用,又能提高疗效[18]。抗体作为靶向修饰物制备IL似乎是提高LPs靶向不足的有效方法[19]。目前,对于IL 的研究仍有不足,需要考虑到抗体的半衰期较短,且储存条件较为苛刻,不利于LPs递药系统的大规模应用,同时,当抗体与抗原结合时,其自身就会产生细胞毒性,这些细胞毒性是否影响IL 的功能还需要进一步的研究。相信随着技术的发展,IL 的临床应用也有望成为现实。

3 糖基修饰的脂质体

糖类是细胞能量的主要来源,细胞通过糖酵解产生ATP来供给能量。肿瘤细胞相比于正常细胞,失去生长控制能力,因此需要摄入大量的ATP 来维持生存,而细胞膜表面葡萄糖转运体(glucose transporters,GLUT)的表达增加可以满足这一要求,GLUT不仅特异性转运葡萄糖,还能转运半乳糖、甘露糖及其衍生物等[29],同时,糖类还参与细胞的许多代谢过程。此外,基于不同细胞的特点,细胞表面还会特异性表达多种糖受体,这提示,可以将糖基作为配体来修饰LPs,实现靶向肿瘤细胞目的。

3.1 葡萄糖及其衍生物修饰的脂质体

葡萄糖是细胞能量来源的基本物质,一般细胞表面都会表达GLUT用于摄入葡萄糖,由于肿瘤失去生长控制能力,对于能量的需求极大,这就导致肿瘤细胞表面会过量表达GLUT 来维持其能量需求,葡萄糖修饰的LPs就是利用肿瘤细胞表面过表达的GLUT为靶向目标来实现肿瘤细胞的精准靶向药物递送[30]。Mu 等[31]设计了一种新型功能性葡萄糖偶联材料TPGS1000-Glu,由葡萄糖衍生物4-氨基苯基-D-吡喃葡萄糖苷(4-aminophenyl-β-Dglucopyranoside,Glu)和维生素E 衍生物D-α-生育酚聚乙二醇1000 琥珀酸酯(D-α-tocopherol polyethylene glycol 1000 succinate,TPGS1000)组成,Glu 具有肿瘤靶向性,TPGS1000 具有抑制肿瘤药物外排和改善药物溶解性的作用,TPGS1000-Glu 通过插入到LPs 以实现肿瘤靶向的目的,同时LPs携带表阿霉素用于治疗脑胶质瘤。实验结果表明,TPGS1000-Glu 修饰的表阿霉素LPs 包封率高且多分散指数小,与非靶向LPs对比,其不仅能够跨过血脑屏障(blood brain barrier,BBB),同时具有更强的药物摄取和抗胶质瘤作用。Shen等[32]利用烷基葡萄糖苷的葡萄糖片段作为靶向头部对LPs进行修饰,包载双氢青蒿素(dihy-droartemisinin,DHA)用于抗肝癌治疗。实验结果显示,该LPs对人肝癌细胞HepG2 具有良好的靶向性,抗肿瘤活性明显增加。

利用葡萄糖作为靶向配体是一种很有前途的修饰方式,葡萄糖来源广、价格低,且GLUT在肿瘤细胞上高表达,这为葡萄糖的应用提供了可能性。当然,目前关于葡萄糖作为靶向配体的研究还比较少,且研究多以体外实验进行,仍需要进行更多的相关性实验来对这种修饰方式进行检验。

3.2 半乳糖及其衍生物修饰的脂质体

半乳糖(galactose, Gal)是广泛存在于奶产品或甜菜中的一种单糖,是某些糖蛋白的重要成分。肝细胞表面存在一类半乳糖受体,也被称为唾液酸糖蛋白受体(asialoglycoprotein receptor,ASGPR),可以特异性与Gal 结合,以受体介导的胞吞作用大量摄入Gal 进行分解代谢和再循环[33-34]。因此Gal可以作为靶向修饰物,实现药物载体的肝癌细胞靶向。

Liu 等[35]制备了包载去甲斑螯素片的ASGPR靶向LPs。该LPs 是利用二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺- 聚乙二醇(1, 2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-Poly,DSPE-PEG) 与Gal 结合形成半乳糖化LPs(Gal-Lipo)。GAL-Lipo 通过其LPs 外侧的Gal 末端分子和HepG2 细胞上的ASGPR 选择性结合,然后利用受体介导的胞吞作用将携带药物的LPs摄入HepG2细胞内达到富集药物的作用。体外实验表明,相比于未经Gal修饰的LPs,GAL-Lipo 被显著地内化到HepG2 细胞中,这也意味着更多的药物能被输送到细胞内。Wang等[36]制备了以Gal修饰的LPs,以热激活延迟荧光(thermally activated delayed fluorescence,TADF)为荧光探针评价LPs靶向肿瘤细胞的能力,共聚焦显微镜和流式细胞仪检测结果表明,与空白PEGDSPE 修 饰 的LPs 相 比,HepG2 细 胞 对Gal-PEGDSPE修饰的LPs的摄取效率更高。

Gal 修饰的LPs 展现出了其优异的肝癌细胞靶向能力,通过与ASGPR 结合,将LPs 以受体介导的胞吞作用摄入细胞。因此,Gal是肝癌细胞靶向载体理想的修饰物。当然,Gal 修饰的LPs 也存在需要解决的问题,虽然,Gal 修饰的LPs 可以相对精准定位于肝癌细胞,但是在肝癌治疗中,如何避免对正常肝细胞损伤还需要更为深入的研究。

3.3 甘露糖及其衍生物修饰的脂质体

甘露糖(mannose,Man)是一种单糖,是多种多糖的重要组成成分,在人体代谢过程中,具有重要作用。Man 可以与甘露糖受体(mannose receptor,MR)结合,用于修饰药物载体进行癌症治疗[30]。MR 是一种高效的内源性受体。其功能包括清除内源性分子、促进抗原提呈、调节细胞活化和运输。它在肿瘤转移和免疫逃避中也起着重要作用[37-38]。

Xiong 等[38]以包载PTX 的LPs 为基础,通过在LPs 表面插入Man,制备了Man 修饰的紫杉醇LPs (PTX-Man Lips),该LPs能够靶向MR,用于提高PTX对MR高表达的结直肠癌的治疗作用。小鼠体内实验结果显示,在治疗21 d后,相比生理盐水 组、PTX-Lips 组、Man Lips 组 和PTX-Lips 组,PTX-Man Lips 显示出更高的抗肿瘤活性,同时与生理盐水对照组相比,PTX-Man Lips 肿瘤抑制率为69.79%。表明Man 修饰的LPs 有可能成为结直肠癌靶向治疗的潜在给药系统。

天然糖类物质具有较好的生物安全性和生物降解性,获取来源广,价格低廉,有良好的靶向功能,因此具有广泛的应用前景[34]。表1 例举了以糖类为靶向修饰物的相关信息。利用细胞膜表面的糖受体与糖类物质特异性结合是该修饰的关键。在研究中,需要考虑细胞表面相应糖受体表达的差异性。此外,糖类修饰的LPs所产生的细胞毒性还未见系统性报道。目前,糖类修饰LPs的研究尚处于初步阶段,仍有大量问题需要解决,但是相信随着技术的发展,糖类修饰的LPs可以取得更大进步。

Table 1 Summary of targeting liposomes with glycosylation modifications表1 糖基化修饰的靶向脂质体汇总

4 配体修饰的脂质体

由于癌细胞基因表达的改变,不同癌细胞会过度表达一些特殊的受体,而正常细胞低表达或不表达这些受体。因此,在LPs表面修饰上可以与这些受体结合的配体,能够使LPs特异性地识别这些癌细胞或组织,实现靶向递送[40]。目前,基于细胞表面受体特异性结合的配体研究主要集中于叶酸(folic acid, FA)、 表 皮 生 长 因 子(epidermal growth factor,EGF) 及 转 铁 蛋 白(transferrin,TF)等。

4.1 叶酸修饰的脂质体

FA 是一种水溶性维生素,是机体中参与一碳单位转移的重要辅助因子,也是基因复制的必需物质。叶酸受体(folate receptor,FAR)是细胞有效摄入FA而特异性表达的糖蛋白膜受体,对FA具有高亲和力。当FA 与靶细胞上FAR 特异性结合时,能通过受体介导的内吞作用被内化进入细胞,研究发现在一些肿瘤细胞表面会高表达FAR,以便摄取更多的FA,这提示FAR 可以作为潜在的靶点用于肿瘤靶向治疗[41-42]。

Nguyen 等[43]制 备 了FA 修 饰 的 靶 向LPs(FA@AuNR-DOX-LPs)协同化疗和光热疗法治疗乳腺癌。如图3所示,该LPs表面修饰FA,内部包裹金纳米棒(AuNR)和DOX。通过对比FA 修饰的LPs 与非靶向LPs 的实验结果表明,FA 修饰的LPs具有更高的细胞摄入率,表明其具有更强的靶向能力。此外,荷瘤小鼠体内实验表明,靶向LPs联合治疗可以有效抑制肿瘤的生长。Tie等[44]则利用FA 修饰的LPs(F-PLP/pBIM)递送BIM-S基因来治疗肺癌。BIM-S基因翻译促凋亡蛋白BIM,BIM已被证明是细胞凋亡的关键调节因子。实验结果显示,F-PLP/pBIM 能特异性抑制肺癌生长,减少肿瘤结节数,减轻肿瘤重量。

Fig. 3 Schematic of FA-modified liposomes co-encapsulated by AuNR and DOX for treating breast cancer[43]图3 AuNR和DOX共同包封的FA修饰的脂质体治疗乳腺癌示意图[43]

FA 作为靶向修饰物的研究已经受到广泛的关注,因为FAR 在多种肿瘤细胞中高表达。许多研究证明,FA 可以非常高效地将LPs 携带进入肿瘤细胞。虽然,FA 修饰的LPs 研究取得了较大的进展,但是仍有一些问题有待解决,例如,FA 修饰的LPs进入细胞后的释放机制仍不明确,由此所带来的可能的细胞毒性也需要进一步的阐明。

4.2 表皮生长因子修饰的脂质体

EGFR是细胞生理的重要调节因子,在细胞增殖、存活和分化过程中起着重要的调节作用[45]。当EGF结合EGFR后,会引发EGFR的二聚化和内源性激酶的激活,然后通过网格蛋白依赖的胞吞作用内化EGF。EGFR的激活通常会导致细胞生长和增殖。研究表明,当细胞发生癌变时,EGFR过表达,正常细胞一般每个细胞表达4×104~1×105个EGFR,而肿瘤细胞每个细胞可表达2×106个EGFR,导致肿瘤细胞快速增殖,这使得EGFR 成为理想的靶向研究位点[46]。

Thomas等[47]报道了一种具有EGFR靶向能力的LPs(111In-EGF-LP-Dox),该LPs装载DOX的同时进行高剂量的放射性111In 标记。研究对比了EGFR 高表达的MDA-MB-468 和低表达的MCF-7两种细胞的细胞摄取差异,111In-EGF-LP-Dox 在MDA-MB-468 细胞中摄取量更多,且联合治疗的实验组对肿瘤细胞杀伤效果更好。Wang 等[48]为了克服顺铂(cisplatin,CDDP)的毒副作用和低水溶解性,使用海藻酸钠(sodium alginate,SA)包裹CDDP,构建了以顺铂-海藻酸钠(CS)为偶联物的LPs(CS-EGF-Lip),并在LPs 上插入EGF用于靶向治疗EGFR高表达的卵巢癌。实验结果显示,对比非靶向的LPs 和游离的CDDP,CS-EGFLip能明显抑制肿瘤的生长和迁移,基本不会影响小鼠的体重,且肾毒性较低。Huang 等[49]将酵母胞嘧啶脱氨酶(yeast cytosine deaminase,Fcy)和人表皮生长因子(human EGF,hEGF)利用基因工程技术形成融合蛋白Fcy-hEGF,然后将FcyhEGF 插入到包裹治疗用放射性核素188Re 的LPs 表面,构建了新型LPs(188Re-liposome-Fcy-hEGF)。融合蛋白Fcy-hEGF能够与EGFR结合,同时,Fcy可以将5-氟胞嘧啶(5-fluorocytosine,5-FC)酶促转化为1 000倍毒性的5-FU以达到杀伤肿瘤细胞的效果。

4.3 转铁蛋白修饰的脂质体

TF 是一种能够以高亲和力可逆结合三价铁原子的蛋白质,通过与细胞膜上的转铁蛋白受体(transferrin receptor,TFR)结合从而将结合的铁原子内化进细胞[50]。TFR 在各种正常组织上普遍表达,反映了细胞对铁的代谢需求。多项研究表明相对于正常细胞,肿瘤细胞表面的TFR 表达上调[51],这使得TF成为精准治疗的有效靶点。

Jhaveri 等[52]设 计 了 修 饰 有TF 的LPs(TF-RES-L), 将 包 载 的 药 物 白 藜 芦 醇(resveratrol,Res) 靶向到神经胶质母细胞瘤(glioblastoma,GBM),以实现肿瘤细胞的定向杀伤。细胞实验结果显示,当Res 浓度约为200 μmol/L时,非靶向LPs(Res-L)处理的细胞存活率为61.9%,TF-RES-L 处理的细胞存活率为54.2%。体内实验表明,TF-RES-L对裸鼠的肿瘤生长抑制作用明显优于对照组,表明TF 的修饰可以为LPs 提供有效的靶向性。全乳铁蛋白(hololactoferrin,Lf)是一种天然的铁饱和乳铁蛋白,具有多种生理功能,可作为TFR 的潜在配体[53]。Zhang 等[53]利用全乳铁蛋白修饰包载DOX 的LPs(Lf-Liposome-Dox)。实验结果显示,该LPs 不仅可以靶向蓄积在TFR 高表达的肿瘤细胞中,还可以催化H2O2转化为氧气,能有效缓解肿瘤缺氧微环境,并可以结合在X 射线(X-ray)的照射下增强其化疗效果,显著抑制小鼠体内的肿瘤生长。该实验结果提示全乳铁蛋白LPs 有巨大的肿瘤治疗潜力。

总之,依赖于受体的主动靶向LPs很有临床应用前景,但该系统有一个亟需解决的问题,即受体是正常细胞存活所必需的,当以肿瘤细胞过表达的受体为靶标时,难免会因为正常细胞也存在本底水平的受体表达而被“误伤”。虽然配体修饰的LPs仍有很多尚未解决的问题,但其已在靶向治疗研究中显示出巨大优势。

5 核酸适配体修饰的脂质体

核酸适配体(aptamers)是通过富集配体系统进化技术(SELEX)从随机的DNA或RNA文库中筛选出来的一类具有高特异性、强亲和力、能精准识别目标物的单链寡聚核苷酸[54-55],aptamer 可通过二、三级结构的折叠形成特定的三维空间构型与靶分子高亲和性、高特异性地相互作用[56]。Aptamer的目标物具有多样性,不仅能与小分子结合,甚至能与整个生物体结合[57]。相比于传统的抗体,aptamer 具有合成简单、分子质量更低、稳定性更高、毒性更低、程序可控等优点[58]。此外,有研究表明,在肿瘤学领域,aptamer 不会在全身给药中刺激免疫系统的Fc 区域,同时具有更高的肿瘤穿透性、保留性,且能够均匀分布[59-61]。Aptamers 根据其合成类型可分为DNA 和RNA两类。

5.1 DNA核酸适配体修饰的脂质体

Cao 等[62]于2009 年第一次利用aptamer 修饰LPs,用于药物的靶向递送治疗。该LPs包载顺铂,表面修饰有适配体AS1411 (5'-GGT GGT GGT GGT TGT GGT GGT GGT GGT TTT TTT TTT TT-3')。AS1411 与核仁素有很高的亲和力,核仁素在多种癌细胞表面过度表达,利用这个特性,AS1411 修饰的LPs可以特异靶向癌细胞表面,将杀伤性药物富集于癌细胞内,达到精准治疗的目的。Yu 等[63]同样利用适配体AS1411(5'-GGT GGT GGT GGT TGT GGT GGT GGT GG-3')作为靶向修饰物制备出了AS1411 适配体功能化LPs (AS1411/Lipo-PTX-siPLK1),该LPs 同时包载有PTX 和PLK1 siRNA(siPLK1)用于对乳腺癌的治疗。细胞实验结果显示,AS1411/Lipo-PTX-siPLK1可以使MCF-7细胞的PLK1 mRNA 表达下调约79%,而对照的PBS 组AS1411/Lipo-PTX-siCTR(非特异性siRNA组)则无明显的下调作用。体内的抗肿瘤活性结果显示,经S1411/Lipo-PTX-siPLK1 注射治疗后,肿瘤生长明显受到抑制,且荷瘤小鼠的存活时间延长。Ara 等[64]分离到一个DNA 适配体AraHH001(5'-ACG TAC CGA CTT CGT ATG CCA ACA GCC CTT TAT CCA CCT C-3'),AraHH001 可以特异性识别鼠肿瘤内皮细胞(mouse tumor endothelial cells, mTECs),并利用该适配体修饰PEG 化LPs给药系统(APT-PEG-LPs)。研究结果表明,适配体能有效增强mTECs 细胞对于APT-PEG-LPs 的摄取,并在一定程度上具有内体逃逸能力。CRISPR/Cas9 是一种功能强大的基因编辑工具,具有特异性强、效率高等特点[65]。Liang 等[66]将CRISPR/Cas9技术与靶向修饰LPs结合,制备了一种可靶向骨肉瘤(osteosarcoma,OS)细胞的LPs递送系统,该递送系统包裹编码血管内皮生长因子A(vascular EGF A, VEGFA) gDNA 和Cas9 的CRISPR/Cas9 质粒,表面修饰有靶向OS 细胞的适配 体LC09 (5'-GCT AAG CGG GTG GGA CTT CCT AGT CCC ACC CGC TTA GCA AAG TAG CGT GCA CTT TTG-3')。实验结果表明,该系统促进了CRISPR/Cas9 在肺病变的原位OS 组织和转移性OS 组织中的选择性分布,并且有效降低了VEGFA的表达和分泌,抑制了原位OS的恶性肿瘤的转移,减少血管生成,且未检测到毒性。Song等[67]筛选出可以靶向识别4T1细胞的适配体SRZ1(5'-CCT GAC AGT CGA GAC-N30-CAC CGG GGT CCT AGG-3'),将该适配体修饰于包载DOX 的LPs,用于靶向递送药物到4T1 细胞中以达到治疗目的。实验结果表明,SRZ1 修饰后的LPs 相比于空白LPs 而言,其细胞摄入率更高,肿瘤杀伤力更强。

5.2 RNA核酸适配体修饰的脂质体

Baek等[68]合成了一种与前列腺特异性膜抗原(prostate specific membrane antigen, PSMA) 的RNA 适配体(5'-GGGAGGACGAUGCGGACCGAAAAAGACCUGACUUCUAUACUAAGUCUACGUUCCCAGACGACUCGCCCGA-3') 偶 联 的LPs(DOX-Aptamosome),利用适配体与膜上抗原结合,将包载DOX 的LPs 内吞进前列腺癌细胞LNCaP,以杀死癌细胞。细胞实验结果表明,对比PSMA 阴性细胞PC-3,LNCaP 细胞内有明显的荧光,而PC-3 细胞则没有观察到荧光,同时通过与缺乏PSMA 适配体的对照LPs 对比,发现DOXAptamosome对LNCaP细胞的毒性明显更大。小鼠实验结果显示,DOX-Aptamosome主要分布在肿瘤和肝、肾中,并且随着时间推移,肝、肾中的DOX-Aptamosome的分布在逐渐减少,小鼠体内的肿瘤体积也在减小。这些结果表明,通过将药物包裹在RNA 适配体修饰的LPs 中是一种潜在的靶向给药策略。Bandekar 等[69]同样利用PSMA 适配体A10 作为靶向修饰物,包载α 粒子生成器225Ac,利用225Ac 的高放射性实现杀死肿瘤细胞的目的。实验结果表明,每个LPs 表面平均结合有(9±2)个A10,平均粒径为(107±2)nm,且能够很好地选择性结合、内化和杀死PSMA 阳性的癌细胞。Zhen 等[70]利用A10 作为靶向修饰物,包载PLK1 CRISPR/Cas9系统,该系统可以沉默肿瘤细胞中生存基因Polo样蛋白激酶1,进而实现杀死肿瘤细胞的目的。实验结果显示,A10-LPs-CRISPR/Cas9递送嵌合体能有效地靶向肿瘤细胞,在体外不仅具有显著的基因沉默能力,同时在体内可以观察到明显的肿瘤消退作用,且免疫应答低。Moosavian等[71]制备了由TSA14 (5'-GCTGGAGCATTTATGGATGAACCTTGGACGGAA-3') 修 饰 的 包 载DOX的LPs(aptamer-PL-Dox),TSA14 与Tubo 细胞有很高的亲和力,Tubo 细胞是一种从BALB-neuT 小鼠乳腺癌体外建立的克隆系,过表达HER-2 受体(HER2/erb-2)。通过与非靶向LPs 相比,aptamer-PL-Dox在Tubo乳腺细胞系中的摄取率更高,毒性作用更强,肿瘤中Dox的蓄积也更多,抗肿瘤能力也有很大提高。Ma 等[72]制备了适配体A15(5'-CCCUCCUACAUAGGG-3')修饰包载姜黄素的LPs用于前列腺癌治疗。CD133是前列腺癌细胞表面高表达膜蛋白,适配体A15 可以和CD133 特异性结合,同时姜黄素作为一种植物化学物质在治疗前列腺癌方面显示出巨大的潜力。该LPs在体内外的实验结果都显示出其具有良好的靶向抗肿瘤效果。

Aptamers 作为一种人工合成的短的单链DNA或RNA 分子,可以高亲和力和特异性地与靶标结合。研究表明,相比于抗体而言,aptamers较小的体积使其拥有比抗体更高的肿瘤穿透性,附着在纳米颗粒表面的过程也比抗体更容易和更具重复性[61]。目前aptamers 已在癌症治疗研究方面受到关注,作为一种新兴的技术手段,仍有许多问题需要克服,例如,aptamers需要从随机单链核酸序列文库中筛选出来,具有很强的随机性,无法通过人工设计,这显著提高了aptamers 的制造成本。此外,由于人体的循环系统中存在核糖核酸酶,因此,aptamers的稳定性也需要评估。期望随着研究的深入和技术的发展,aptamers的应用迎来更好的前景。

6 多靶向修饰脂质体

单一靶向修饰的LPs 发展至今已经比较成熟,然而,在临床应用中仍有不足之处。针对癌细胞受体的单靶向修饰往往会因为正常细胞也表达了相应受体而造成非选择性的毒性。为了解决这个问题,研究者们探索出对LPs进行多靶点修饰的策略,进一步提高了LPs递药系统的精准靶向性。

甘草次酸受体(glycyrrhetinic acid recptor,GA-R)在大鼠肝实质细胞膜表面大量表达,肝癌组织中的GA-R 的表达是邻近正常肝组织的1.5~5倍[73],单独使用GA修饰的LPs可能会引起正常肝细胞的损伤。为了解决这个问题,Li 等[74]在GA修饰DOX 脂质体的基础上,将花生凝集素(peanut agglutinin,PNA)插入到LPs 表面,PNA可以与癌细胞上过表达的黏蛋白1 (mucin 1,MUC1)特异性结合,利用PNA和GA制成双配体修饰的LPs(DOX-GA/PNA-Lips),从而实现对肝癌细胞的主动靶向,避免对正常肝细胞的伤害。以MUC1阳性肝癌细胞株SMMC07721 为靶细胞的体外实验结果表明,DOX-GA/PNA-Lips 对细胞的毒性作用最强,其IC50值为(7.4±0.79)μg/L,是游离DOX 的1/7,是无配体修饰LPs 的1/2,是单配体修饰LPs 的2/3,显示出双配体修饰的高靶向性和药物传递效率。

多靶向修饰除了能够提高LPs递药系统的靶向准确性,还可以被设计用于层级靶向递送。脑胶质瘤是最常见的颅内肿瘤,然而由于存在BBB,因此常规的LPs 无法精准到达脑部肿瘤部位。Gao等[75]开发了由FA 和TF 双修饰的LPs,可以实现多级靶向,将药物准确的送达脑胶质瘤。TF 负责将LPs 特异靶向到BBB 上的TFR,在穿过BBB 之后,FA 可以特异性的靶向脑胶质瘤细胞上过表达的FAR,最终达到将LPs包封的药物运输到脑胶质瘤的目的。Wang等[76]设计了可以靶向肝癌细胞溶酶体的LPs(Gal-Mor-LPs),该LPs 表面修饰Gal和吗啉(morpholine,Mor),内部包载姜黄素。Gal 可以识别肝癌细胞上过表达的半乳糖受体,Mor 可以靶向溶酶体。实验结果显示,Gal-Mor-LPs 比LPs 和Gal-LPs 有着更好的溶酶体靶向性,且抗肿瘤作用也更强。

通过对LPs 进行多靶向修饰设计,使LPs 具有更优异的细胞选择性、细胞摄取或肿瘤穿透能力,在肿瘤靶向治疗中显示出巨大优势。但是,在设计多靶向载体时应进行多方面评估,如配体的密度、位置、与受体的亲和力等对靶向效果有较大影响的因素[77]。目前,多靶向修饰已经受到研究人员的极大关注,通过在纳米药物载体表面修饰不同靶标物,不仅可以提高肿瘤靶向递送效果,更能赋予纳米药物载体更多功能,如克服BBB 和靶向细胞器等。因此,未来应更多地关注多靶向纳米药物载体的设计,以促进其临床应用。

7 展 望

随着癌症发病率愈来愈高,其治疗方法的研究也在不断提升,然而,癌细胞耐药性以及复发转移使得癌症的根治成为难点。精准杀死癌细胞是癌症治疗的最高目标。目前化疗药物是主要的癌症治疗方法之一,但是化疗药物在产生作用时,往往会波及到正常的细胞,这使得癌症治疗的副作用比较大,所以亟需对化疗药物进行组合优化研究。LPs作为一种药物载体,有着巨大的应用潜力,能将药物包裹起来,通过对LPs 的靶向修饰,还可以使LPs拥有精准定位肿瘤细胞并释放药物的能力,增强药物的有效利用率,减少毒副作用。

本文概述了近年来靶向修饰LPs递送系统的研究进展,并对其进行了分类综述。目前的LPs研究主要集中在对其表面进行靶向修饰,也有很多结合其他治疗手段,如化疗、光疗、免疫疗法等对肿瘤细胞进行联合治疗。虽然靶向LPs递药系统的优点明显,但是由于许多靶向受体在正常细胞中也存在本底表达,这导致LPs递药系统也会被正常细胞识别摄入而引起不良反应。另外,LPs递药系统的精准控制释放也是个亟需解决的问题,若能解决上述问题,LPs递药系统的研发和临床应用将获得更大提升,也将进一步推动癌症治疗研究的发展。

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