中华猕猴桃根提取物增敏索拉非尼对H22肝癌小鼠移植瘤生长及TNF-α的影响

袁 媛,任东峰,陈晓泉,蒋 喆

(1. 陕西省肿瘤医院,陕西 西安 710061;2. 榆林市第一医院,陕西 榆林 718000)

肝细胞肝癌约占原发性肝癌的75%～85%,是世界范围内常见的消化系统恶性肿瘤。慢性病毒性肝炎、长期酗酒、非酒精脂肪性肝炎、食用黄曲霉毒素污染的食物、血吸虫病等多种原因引起的肝硬化以及有肝癌家族史的人群高发,该病预后很差,发病率与死亡之比约为1∶0.9[1]。手术是治疗肝细胞肝癌的重要手段,但仅有少数患者确诊时具有手术或肝移植机会,且5年复发率高达50%～70%[2]。索拉非尼是最早用于肝细胞肝癌系统抗肿瘤治疗的分子靶向药物,大型、随机对照的国际多中心临床试验研究表明该药能够延缓晚期肿瘤无进展生存期(PFS)、总生存期(OS)[3-4],因此从2007年以来,索拉非尼已经包括我国在内的全球180多个国家药监部门批准用于一线治疗无法手术切除或远处转移的肝细胞肝癌患者,并列入多国的肝癌临床指南或专家共识。但该药长期、单一口服不可避免地会出现高血压、腹泻、皮疹及低磷酸盐血症等不良反应,无法耐受者需要停药,影响总体疗效。因此,开发针对肝细胞肝癌转移和复发的新型靶向药物或联合天然中草药治疗具有重要意义。猕猴桃根又名藤梨根、红藤梨,是猕猴桃科猕猴桃属植物,其具有抗肿瘤、抗氧化、保肝、降糖等作用,对胃癌、结肠癌、肝癌、肺癌均有明显的抗肿瘤作用,但其具体的作用机制尚不十分明确[5]。肿瘤坏死因子-α(TNF-α)是一种促炎因子,肿瘤状态下可诱导其高表达,参与肿瘤细胞扩增、增殖[6]。本实验观察了猕猴桃根提取物对H22肝癌小鼠移植瘤生长及TNF-α表达的影响,从炎症反应角度探讨猕猴桃根提取物的抗肿瘤疗效与机制,旨在为临床开发治疗晚期肝细胞肝癌的新药提供客观依据。

1 实验材料与方法

1.1实验动物 健康昆明种小鼠24只,雌雄各半,鼠龄6～7周,体重(22±2)g,购于西安市长安区斗门实验动物养殖科技有限公司,动物合格证号:医动字第20-005号。饲养于西安交通大学第一附属医院医学转化中心实验室,饲养环境温度(23±2)℃,相对湿度(50±5)%,通风动物房平台特定病原体(SPF)环境,按实验动物使用的“3R”原则给予动物人道关怀。

1.2实验瘤株 H22肝癌腹水瘤瘤株,购自第四军医大学实验动物中心,昆明小鼠腹腔内传代。

1.3主要药品及制备 野生中华猕猴桃根购自西安市中药材市场,参照文献[7]方法,取50 g磨成粉,悬浮于10倍体积的双蒸馏水中,加热至100 ℃ 1 h,然后将汤剂过滤,整个提取过程重复2次,收集提取物(浓度200 μg/mL ),4～8 ℃冷藏备用。甲苯磺酸索拉菲尼片(Sorafenib德国拜耳先灵医药,国药准字H20110599,规格:0.2 g/片),按照成人40 mg/kg换算小鼠给药剂量[8],将索拉非尼200 mg加入蒸馏水100 mL配制成混悬液,即每 0.5 mL含有1 mg索拉非尼。

1.4主要仪器 光学显微镜(广西梧州市光学仪器厂),水平离心机(LD-42型,北京医用离心机厂),超净工作台(苏州净化设备厂),精密电子称(上海第二分析仪器厂),电热恒温培养箱(上海精宏实验设备有限公司),电子天平(上海精密科学仪器有限公司天平仪器厂),微量移动液器、冰箱 (西安交通大学第一附属医院医学转化中心实验室提供),活体荧光影像系统(I.C.E．,日本Roper公司)。

1.5实验方法 将腹腔内传代H22肝癌瘤株的小鼠脱颈椎处死,浸泡于95%乙醇中5 min,在超净工作台无菌条件下抽取瘤液(呈淡奶白色),置于离心机内1 500 r/min离心2 min,弃去上层淡色较清亮腹水,保留下层较浓稠呈稀糊样的半液态物,用新鲜配制的0.02%台盼蓝染色,混匀后在血细胞计数盘上计数,染色者为死细胞,不染色者为活细胞,计算活细胞数,用生理盐水调整细胞浓度至2.0×106/mL,然后用0.5 mL注射器,以0.2 mL/只接种于24只小鼠腹腔皮下,制作成移植瘤模型。将24只造模成功的小鼠按随机数字表分为4组,每组6只。 肝癌组给予生理盐水灌胃,猕猴桃根提取物组给予中华猕猴桃根提取物灌胃,索拉非尼组给予索拉非尼灌胃,联合组给予中华猕猴桃根提取物和索拉非尼灌胃,前3组均于每天9:00灌胃,联合组的索拉非尼在每天15:00灌胃,灌胃量均为0.5 mL/只,1次/d,连续灌胃15 d。灌胃结束后次日处死。

1.6检测指标及方法

1.6.1小鼠机体状态 每日观察小鼠的自主活动、精神状态、毛发、呼吸、饮食、粪便性状及对外界刺激的反应。

1.6.2小鼠移植瘤生长情况 荧光素酶标记各组小鼠移植瘤生长情况,分别在瘤移植的第0,5,10,15天于小鼠腹腔注射荧光素底物(1.5 mg/10 g),饱和三溴乙醇(0.18 mL/10 g)麻醉后放入活体荧光影像系统摄像,Slide Book 4.0软件进行分析。

1.6.3瘤重及抑瘤率 灌胃结束后次日处死小鼠,用镊子镊住腹腔肿瘤生长部位皮肤后用手术剪剪开皮肤,暴露肿瘤,去除血污,用手术剪钝性剥离肿瘤,称瘤重,计算抑瘤率。抑瘤率(%)=[1-(平均用药组瘤重/平均对照组瘤重)]×100%。

1.6.4TNF-α表达情况 采用免疫组化染色法检测:移植瘤经10%多聚甲醛固定,梯度脱水,石蜡包埋后5～7 μm连续切片,捞片后置60 ℃烤箱60 min使切片紧密黏附,石蜡水化,PBS洗涤,30% H2O2溶液室温作用10 min去内源酶活性;浸入0.01 mol/L柠檬酸缓冲液(pH 6.0)中,微波抗原修复10 min;自然冷却后加蒸馏水洗2 min,3次;加入兔抗小鼠TNF-α单抗(1∶80),4 ℃冰箱过夜;PBS洗涤后,加入生物素化小鼠IgG室温孵育20 min;PBS液洗涤3次后,滴加试剂SABC,室温孵育20 min,PBS液洗涤5 min,4次;取1 mL蒸馏水,加DAB显色试剂盒中A、B、C试剂各1滴,混匀后加至切片,室温显色,镜下控制反应时间,蒸馏水洗涤;苏木素复染,脱水,透明,中性树胶封片。阳性片作为阳性对照,用PBS液代替一抗作为阴性对照,荧光显微镜下观察、拍照,以上所有指标检测均严格按照试剂盒操作说明进行。TNF-α主要表达在胞浆,阳性染色呈棕黑色颗粒。高倍镜下取4个不同视野各计数200个细胞,按阳性细胞数所占的百分比进行定量,用计算机图像分析系统(江苏捷达形态学分析软件JEDA801D)计算阳性表达率。

2 结 果

2.1各组小鼠机体状态 实验过程中各组未出现死亡现象,联合组和索拉非尼组进食状况均良好,未见腹泻,活动正常,体重增加,对刺激反应灵敏,毛色光亮。猕猴桃根提取物组进食欠加,未见腹泻,活动正常,体重增加不明显,对刺激反应欠灵敏,毛色欠光滑;肝癌组出现厌食,腹泻,体重减轻,精神萎靡,对刺激反应迟钝,毛色灰暗。

2.2各组小鼠移植瘤生长情况 在光子数3×104～2×106范围内,肝癌组和猕猴桃根提取物组发光强度随移植瘤增长逐渐增强,索拉非尼组和联合组发光强度变化不明显。见图1。

图1 各组小鼠肝癌细胞移植后第0,5,10,15天荧光素酶标记影像表现

2.3各组小鼠出瘤时间比较 肝癌组、猕猴桃根提取物组、索拉非尼组、联合组小鼠出瘤时间分别为(4.7±1.3)d、(5.7±1.3)d、(7.1±1.2)d、(8.2±0.8)d,索拉非尼组、联合组小鼠出瘤时间均明显长于肝癌组(P均<0.05),联合组小鼠出瘤时间明显长于索拉非尼组(P<0.05),肝癌组与猕猴桃根提取物组出瘤时间比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.4各组小鼠瘤重、抑瘤率比较 猕猴桃根提取物组、索拉非尼组、联合组瘤重均明显低于肝癌组(P均<0.05);索拉非尼组、联合组瘤重均明显低于猕猴桃根提取物组(P均<0.05),抑瘤率均明显高于猕猴桃根提取物组(P均<0.05);联合组瘤重明显低于索拉非尼组(P<0.05),抑瘤率明显高于索拉非尼组(P<0.05)。见表1。

表1 各组肝癌小鼠瘤重及抑瘤率比较

2.5各组小鼠瘤组织中TNF-α表达情况 肝癌组TNF-α表达增多,阳性表达率为(70.35±7.73)%;猕猴桃根提取物组、索拉非尼组、联合组TNF-α表达减少,阳性表达率分别为(53.68±6.22)%、(48.21±4.36)%、(43.21±4.53)%,均明显低于肝癌组(P均<0.05),且索拉非尼组、联合组均明显低于猕猴桃根提取物组(P均<0.05),联合组明显低于索拉非尼组(P<0.05)。见图2。

图2 各组肝癌小鼠瘤组织中TNF-α阳性表达情况(免疫组化染色,×200)

3 讨 论

肝细胞肝癌发病机制尚不明确,其病理生理过程可能与多种基因突变、新生血管异常增生、细胞信号传导通路改变等有关[9]。由于肝细胞肝癌易发生早期播散和转移,且很大一部分为多中心发生,加之患者多伴有严重肝硬化,因此手术切除存在很大局限性。索拉非尼是一种口服的多激酶抑制剂,对于中晚期肝癌患者可延长生存时间2～3个月,单药口服客观缓解率低[10-11],联合治疗是近年临床积极探索的治疗方案。

现代中医药是肿瘤综合治疗的重要组成部分,以中医药理论为指导,辨证论治,与现代医学技术有机结合,可恢复机体动态平衡,改善晚期肿瘤患者的生活质量,延长带瘤生存期。中华猕猴桃根能清热解毒、活血消肿,其主要含三萜类、酚类、蒽醌类、黄酮类、挥发油和糖及糖苷类等化合物[12],其氯仿提取物可抑制喉癌HEP-2细胞增殖。本实验结果显示,索拉非尼组、联合组小鼠出瘤时间均明显长于肝癌组,抑瘤率均明显高于猕猴桃根提取物组;与索拉非尼组比较,联合组小鼠出瘤时间明显延长,抑瘤率更高。提示索拉非尼基础上联合中华猕猴桃提取物干预抑制H22肝癌小鼠肿瘤生长作用更明显。

TNF-α是一种多向性的促炎症反应细胞因子,由多种细胞分泌,正常生理状态下低表达,有助于增强机体免疫力[14];当机体处于肿瘤等病理状态时,可诱导其高表达,激活细胞级联效应,导致机体炎症反应加剧,造成多种病理性损伤,导致或加剧肿瘤细胞增殖[15-16]。本研究中,肝癌组瘤组织中TNF-α阳性表达率均明显高于猕猴桃根提取物组、索拉非尼组、联合组,其中联合组TNF-α阳性表达率明显低于猕猴桃根提取物组和索拉非尼组。提示猕猴桃根提取物能够增敏索拉非尼作用,可以通过降低肿瘤胞浆中TNF-α的表达,抑制炎症反应,控制肿瘤细胞增殖。

综上所述,中华猕猴桃提取物具有增敏索拉非尼抗肝癌细胞作用,机制可能与下调TNF-α在瘤细胞胞浆中的表达,抑制炎症反应,从而抑制肿瘤细胞增殖有关,但其涉及的信号通路尚不明确,有待进一步探讨。

利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突。