双氢青蒿素对肝纤维化大鼠肠道菌群及NLRP3炎性小体的影响

任海霞,郭永泽,李淑霞,王建华,郭晓会,平付敏,王恩雨,单铁强

(1. 河北工程大学附属医院,河北 邯郸 056002;2. 秦皇岛市海港医院,河北 秦皇岛 066000)

肝纤维化为肝脏受到各种化学、生物等有害因素损伤时,肝内组织对其损伤所进行的反应性修复所致的一种病理改变,反复或长期损伤会造成肝组织内的富含纤维结缔组织的修复灶增多,肝脏质地变硬,即发展为肝硬化[1]。因此,肝纤维化为各种慢性肝脏疾病进展成肝硬化的中间阶段,倘若对其不进行及时合理治疗,会继续恶化为肝癌或者肝脏功能衰竭[2]。由于肝纤维化起病诱因繁杂,发病机制尚不明晰,目前尚无特效防治药物。近年来研究认为,肝病的发生和进展与肠道内的菌群数量和种类密切相关[3]。由于肝脏和胆管的胚芽起源于前肠,这种同源性决定了二者出生后功能上的互补作用。除此之外,肠内正常或异常菌群的代谢产物也会运送到肝脏,影响着肝脏组织结构的完整和功能的正常运行[4]。双氢青蒿素为中草药青蒿素的还原产物,具有改善多种组织纤维化、减轻炎症反应及保护肠道菌群稳态等作用[5-6]。基于双氢青蒿素的这些功效,本实验通过观察肝纤维化大鼠肠道菌群、肝组织中纤维化指标及NOD样受体蛋白3(NLRP3)炎性小体相关蛋白表达情况,探讨了双氢青蒿素对肝纤维化的影响及可能作用机制,为防治肝纤维化的新药开发提供新策略。

1 实验材料与方法

1.1实验动物 Sprague Dawley品系SPF级雄性大鼠30只,12周龄,体重200～250 g,购自河北医科大学实验动物中心,许可证号: SCXK(冀) 2021-6011。饲养于温度为(22±2)℃、湿度为50%～60%、无特殊病原体的动物房中,自由摄入水和饲料,动物实验方法、处置手段符合人类公认的道德伦理标准和国际惯例。

1.2主要药物、试剂 双氢青蒿素源自西安展迅生物公司(ZX-ZWTQW-0002),预先溶于0.6%的二甲基亚砜溶液中,置于冰箱冷藏,给药时用适量的生理盐水调配为所需浓度。Ⅰ型胶原、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、NLRP3、半胱氨酸天门冬氨酸酶1(Caspase-1)、白细胞介素-1β(IL-1β)一抗、二抗试剂购自上海莼试生物公司,细菌基因组DNA提取试剂盒(DP328-02,西安齐岳生物公司),SYBR®Premix Ex TaqTM(RR420A,上海拓然生物科技有限公司)。

1.3实验方法 将大鼠随机分为假手术组、肝纤维化组及双氢青蒿素组,每组10只。肝纤维化组和双氢青蒿素组参考文献[7-8]方法建立肝纤维化模型:腹腔注射30 mg/kg戊巴比妥钠麻醉大鼠,剖开下腹中部,完全暴露胆总管及其相连的部分十二指肠,将胆总管与周围组织分离,用手术线结扎后缝合腹部切口;假手术组分离胆总管与周围组织,留线而不结扎,缝合腹部切口。手术过程无菌操作,术后常规饲养。自术后第15天起,双氢青蒿素组大鼠给予20 μg/g的双氢青蒿素溶液5 mL灌胃,假手术组和肝纤维化组大鼠给予含0.6%的二甲基亚砜生理盐水5 mL灌胃,均1次/d,连续灌胃2周。

1.4检测指标及方法

1.4.1肝组织病理形态 末次灌胃结束后第2天,腹腔注射戊巴比妥钠麻醉各组大鼠,取部分肝脏,4%多聚甲醛固定后,进行脱水、透明、包埋,切为5 μm厚的组织片,然后依次经过脱蜡、浓度递减酒精至水、碱性苏木精染色、自来水漂洗、酸性伊红染色、自来水漂洗、透明及晾干封片,显微镜下观察肝组织形态。

1.4.2肠道菌群含量 取各组大鼠盲肠里存留的内容物0.2 g,放入无菌离心管里,存于液氮中,利用DNA检测盒分离出符合标准纯度的全部DNA,明确DNA的含量,置于-80 ℃冰箱中。采用16S rDNA分析乳酸杆菌、双歧杆菌、大肠杆菌的基因序列,设计3种菌群的引物序列。大肠杆菌的正向引物序列为5’-CCCTTATTGTTAGTTGCCAT-3’,反向引物为5’-ACTCGTTGTACTTCCCATTG-3’,乳酸杆菌正向引物为5’-CACCGCTACACATGGAG-3’,反向引物为5’-AGCAGTAGGGAATCTTCCA-3’,双歧杆菌正向引物为5’-TCGCGTCYGGTGTGAAAG-3’,反向引物为5’-CCACATCCAGCRTCCAC-3v。根据荧光定量检测试剂盒的要求制备所需的扩增反应试剂和设置相应合适的反应条件。最后以2-△△CT方法计算目标细菌量。

1.4.3肝组织中相关蛋白表达情况 采用Western blot法检测:取各组大鼠适量肝组织,研磨机中磨为浆液, 4 ℃下滴加适量裂解液充分裂解,分离其中的总蛋白并进行定量。少许蛋白中滴加适量上样缓冲液混匀,浸入沸水中进行热变性,移置预先制备的固态凝胶孔中,设置电泳槽恒压状态下进行电泳,利用转膜仪将胶中的指定蛋白移至薄膜中,浸入无脂奶粉溶液作用2h,分别浸入配好浓度的Ⅰ型胶原(1∶500)、α-SMA(1∶500)、NLRP3(1∶600)、Caspase-1(1∶800)、IL-1β(1∶600)一抗溶液,4℃冰箱中过夜,洗膜后浸入浓度1∶800的二抗溶液,室温作用2 h,洗膜。在避光的条件下滴加显影试剂,定影后扫描膜中蛋白条带的灰度值,采用Image J软件计算每组的平均值。

2 结 果

2.1各组大鼠肝脏组织形态 假手术组大鼠肝小叶轮廓可辨,小叶内的细胞呈索状排列,未见变性与坏死,小叶周围的汇管区结缔组织和管道结构正常。肝纤维化组大鼠肝小叶轮廓破坏,其内可见面积不等的坏死区域,中性粒细胞、淋巴细胞数量增多,汇管区面积增大,其内的结缔组织增生、小胆管数量增多;与肝纤维化组比较,双氢青蒿素组大鼠肝小叶内的坏死区面积缩小,中性粒细胞、淋巴细胞数量减少,汇管区结缔组织和小胆管数量均减少。见图 1。

图1 各组大鼠肝脏组织HE染色表现(×200)

2.2各组大鼠肠道菌群定量 与假手术组比较,肝纤维化组肠道内大肠杆菌相对表达量增加(P<0.05),双歧杆菌、乳酸杆菌相对表达量减少(P均<0.05);与肝纤维化组比较,双氢青蒿素组肠道内大肠杆菌相对表达量减少(P<0.05),双歧杆菌、乳酸杆菌相对表达量增加(P均<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠肠道菌群中大肠杆菌、双歧杆菌、乳酸杆菌相对表达量比较

2.3各组大鼠肝组织中Ⅰ型胶原、α-SMA蛋白表达情况 肝纤维化组肝组织中Ⅰ型胶原、α-SMA蛋白相对表达量均明显高于假手术组(P均<0.05),双氢青蒿素组肝组织中Ⅰ型胶原、α-SMA蛋白相对表达量均明显低于肝纤维化组(P均<0.05)。见图2和表2。

表2 各组大鼠肝组织中纤维化因子蛋白相对表达量比较

图2 各组大鼠肝组织中纤维化因子蛋白表达灰色条带

2.4各组大鼠肝组织中NLRP3炎性小体相关蛋白表达情况 肝纤维化组肝组织中NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白相对表达量均明显高于假手术组(P均<0.05),双氢青蒿素组肝组织中NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白相对表达量均明显低于肝纤维化组(P均<0.05)。见图3和表3。

表3 各组大鼠肝组织中NLRP3炎性小体相关蛋白相对表达量比较

图3 各组大鼠肝组织中NLRP3炎性小体相关蛋白表达灰色条带

3 讨 论

肝纤维化是许多慢性肝脏疾病进展为肝硬化的共有病程阶段,其具有可逆性的特点,但其发病机制尚在探索中,至今无特效的防治措施[9]。本实验采用结扎胆总管的方法制备肝纤维化模型,因胆总管结扎造成肝外胆管阻塞,胆汁淤积在肝内的小胆管内,短期内造成小胆管代偿性的管腔扩张和增生,持续一段时间后,胆汁溢出至肝实质中,压迫其周围的血管,肝细胞缺乏氧气和营养先后出现变性、坏死,肝小叶的正常结构遭到破坏;肝星状细胞受刺激后表型和活性发生变化,表达α-SMA增多并分泌大量的I型胶原等基质成分[10-11],小叶周围的结缔组织异常增生,并伸入到小叶内部,围绕在坏死的肝细胞周围,肝组织形成纤维化改变。

本实验中肝纤维化组大鼠肝组织损伤,肝组织中Ⅰ型胶原、α-SMA蛋白表达增加,说明该造模方法可造成肝纤维化;双氢青蒿素组肝组织损伤较轻,肝组织中Ⅰ型胶原、α-SMA蛋白表达量减少,说明双氢青蒿素可逆转肝纤维化。

目前研究证实,肝脏疾病的发生、进展与肠道菌群的种类、数量密切相关[12-13]。肝脏与肠道在结构、功能方面均存在着相互联系,正常生理状态下,肠肝的这种相互作用维护着肠道菌群的稳态,对机体起到一种免疫防御作用。胆汁是重要的肠道菌群调节物质,胆管结扎造成胆汁代谢紊乱,不仅损伤肝组织结构和功能,而且也损伤肠道内的黏膜屏障,增加毒性物质如有害细菌及其产物、内毒素等透过此屏障进入门静脉运送到肝脏的机会,进一步加重肝组织的炎症和纤维化病变,使其病程加速进展[14-15]。Alaish等[16]研究发现,小鼠行胆总管结扎术后14 d其肠道内的菌群种类及数量均发生了变化。杨博文等[17]的实验显示雄性小鼠结扎胆总管后2周,肠道内的特定菌群数量发生变化,肝脏功能降低,肝组织发生纤维化病变。本实验结果显示,肝纤维化组大鼠肠道内大肠杆菌的含量增加,双歧杆菌、乳酸杆菌的含量减少,证实肝纤维化可导致肠道菌群变化;双氢青蒿素组大肠杆菌的含量减少,双歧杆菌、乳酸杆菌的含量增加,提示双氢青蒿素可调节肠道菌群。

NLRP3炎性小体为和炎症反应密切相关的复合体,其成员主要有NLRP3、ASC接头蛋白以及Caspase-1酶前体[18]。它常位于机体各组织中的单核吞噬细胞系统、嗜中性粒细胞及淋巴细胞的胞质中,当这些细胞遇到相应的刺激时,通过对应的信号转导途径会使此炎性小体合成和激活[19-20]。此小体激活后引发的组织炎性反应通路为促进肝纤维化发展的重要信号途径,此途径中释放的活性IL-1β为炎性反应中起重要作用的生物因子,在组织炎症的早期阶段可造成肝组织结构损伤以及功能降低,加速肝纤维化的进展[21-22]。在采用血吸虫诱导的小鼠肝纤维化组织里,发现NLRP3、Caspase-1及IL-1β的含量均增加,肝星状细胞大量活化且数目增加,这说明NLRP3炎性小体的活化在肝纤维化病程进展中起关键作用,而采用一些方法抑制此炎性小体的表达和活性后,肝纤维化的程度减轻[23-24]。本实验结果显示,肝纤维化组肝组织中NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白表达量明显升高,而双氢青蒿素组NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白表达量均明显降低。说明肝纤维化与NLRP3炎性小体活化密切相关,双氢青蒿素可能通过抑制NLRP3炎性小体活化而减轻肝纤维化。

综上所述,双氢青蒿素可能通过调节肝纤维化大鼠肠道菌群,拮抗NLRP3炎性小体活化而减轻肝纤维化程度。

利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突。