不同辅料炮制对镰形棘豆抗炎与毒性作用的影响∗

黄聪琳，郭 敏，李晓东，王晓琳，邢福军，柳渊洁

1 甘肃省中医院，甘肃 兰州 730050； 2 甘肃省中医药研究院，甘肃 兰州 730050

镰形棘豆为豆科棘豆属多年生草本植物，收录于《中华人民共和国卫生部药品标准（藏药）》第一册，根及根茎或全草入药。镰形棘豆抗炎作用显著，为藏医“三大抗炎药”之一［1］。但其“毒性”问题也颇受争议。镰形棘豆性寒味辛，具小毒。动物长期或大量采食镰形棘豆会引发中毒、流产、致畸等毒性反应［2］，导致其临床药用安全性受到质疑。

中药炮制可存效减毒，炮制后的中药饮片可安全用于临床。对镰形棘豆的炮制，尚未见文献报道。研究表明，镰形棘豆的主要成分为黄酮类、生物碱类、多糖类、挥发油及皂苷等，其中，黄酮类化合物的生物学活性最为广泛，是发挥抗炎作用的主要成分，生物碱是该植物毒性活性的主要成分［3-4］。本研究利用不同辅料对镰形棘豆药材进行炮制，比较镰形棘豆生品和不同炮制品的总黄酮和总生物碱含量的差异及抗炎效果与毒性作用差异。

1 仪器与试药

1.1 试药及试剂藏药镰形棘豆（产地：甘肃），药材经甘肃省药品检验研究院鉴定认可；芦丁标准品（CAS：569-92-6）购自中国食品药品检定研究院；野决明碱对照品（CAS：529-78-2）购自上海源叶生物科技有限公司。龙眼井9度米醋（陕西晋中怀仁荣欣酿造厂）；老闸六年花雕酒（绍兴三江酒厂）；纯牛奶（蒙牛乳业）；阿司匹林肠溶片（拜耳医药保健有限公司，批准文号：国药准字J20171021，规格：100 mg/片）；谷草转氨酶（aspartate transminase，AST）、谷丙转氨酶（alanine transaminase，ALT）、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、肌酐（creatinine，CRE）和乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）生化测定试剂盒（长春汇力生物技术有限公司）；甲醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、乙酸、磷酸、磷酸氢二钠-柠檬酸、三氯甲烷、石油醚等试剂均为分析纯。

1.2 实验仪器DHG-9055 型电热恒温鼓风干燥箱（齐欣，上海）；UV2450 型紫外分光光度计（岛津，日本）；BSA224S 型电子分析天平（赛多利斯，德国）；DFY-600C型万能高速粉碎机（谷宁，上海）；Allegra 64R 型高速低温离心机（贝克曼，美国）；Chemray 420型全自动生化分析仪（雷杜，深圳）。

1.3 实验方法

1.3.1 生品及炮制品制备生品 镰形棘豆药材除去杂质和残茎，切成3 cm小段，即可。醋制：镰形棘豆净制后，加入适量米醋拌匀，闷润12 h，放入60 ℃电热恒温鼓风干燥箱，干燥备用。酒制：镰形棘豆净制后，加入适量黄酒拌匀，闷润12 h，放入60 ℃电热恒温鼓风干燥箱，干燥备用。奶制：镰形棘豆净制后，加入适量牛奶拌匀，置4 ℃冰箱闷润12 h，放入60 ℃电热恒温鼓风干燥箱，干燥备用。

1.3.2 总黄酮提取 将干燥的镰形棘豆粉碎，过80 目筛。准确称取镰形棘豆药材粉末2.0 g，置100 mL 圆底烧瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，称定质量，回流提取2 次，每次1 h，放冷，再称定质量，加70%甲醇补足减失质量，摇匀，滤过。

1.3.3 总黄酮含量测定

1.3.3.1 对照品溶液的制备 精密称取芦丁对照品7.15 mg，加甲醇溶解并定容至25 mL 量瓶中，即得0.286 mg/mL的芦丁对照品溶液。

1.3.3.2 标准曲线的制备 分别精密量取芦丁对照品溶液1、2、3、4、5、6 mL，置25 mL容量瓶中，加水至6 mL，加5%亚硝酸钠溶液1 mL，摇匀，放置6 min，加10%硝酸铝溶液1 mL，摇匀，放置6 min，加10%氢氧化钠溶液10 mL，摇匀，加水至刻度，摇匀，放置15 min，以相应试剂为空白，按紫外-可见分光光度法，于510 nm 处测定吸光度。以吸光度（Y）为纵坐标，对照品浓度（mg/mL）（X）为横坐标，计算回归方程得：Y=12.519X+0.0126，r=0.9992。在0.011 44～0.068 64 mg/mL范围内，线性良好。

1.3.3.3 镰形棘豆 总黄酮含量测定分别精密量取生品及各炮制品总黄酮提取液各3 mL 至25 mL 的容量瓶中，加水至6 mL，按照“1.3.3.2”项方法进行处理，于510 nm 处测定吸光度，并计算镰形棘豆总黄酮的含量。

1.3.4 总生物碱提取 准确称取镰形棘豆药材粉末2.0 g，置具塞锥形瓶中，精密加入2.5%的乙酸20 mL，称质量，超声提取1 h，放冷，再称定质量，加2.5%的乙酸补足减失质量，滤过，滤液用1 mol/L的NaOH碱化至pH 10.0，石油醚振摇提取3 次，每次20 mL，碱水溶液继续用三氯甲烷振摇提取3次，每次20 mL，取三氯甲烷浓缩，以甲醇定容至5 mL量瓶中。

1.3.5 总生物碱含量测定[7]

1.3.5.1 标准曲线的制备 分别精密量取野决明碱对照品溶液0.2、0.4、0.5、0.7、0.8、1.0 mL，挥干甲醇，用少量三氯甲烷溶解，置分液漏斗中，加入磷酸氢二钠-柠檬酸（pH=5.4）5.0 mL，0.05%溴麝香草酚蓝溶液2.0 mL，摇匀，以三氯甲烷8 mL振摇提取，静置2 h 后，取三氯甲烷层，于413 nm处检测吸光度。以吸光度（Y）为纵坐标，对照品进样量（μg）（X）为横坐标，计算回归方程得：Y=0.0098X+0.0125，r=0.9993。野决明碱进样量在16.5～82.5 μg范围内，线性良好。

1.3.5.2 镰形棘豆药材 总生物碱含量测定分别精密量取生品及各炮制品总生物碱提取液各1 mL，挥干甲醇，按照“1.3.5.1”项处理，于波长413 nm处测定吸光度，并计算镰形棘豆总生物碱的含量。

1.3.6 中药药液制备 分别称取镰形棘豆生品及醋制品、酒制品、奶制品适量，置不锈钢锅内，加入20 倍量蒸馏水（w∶v=1∶20），浸泡0.5 h，130 ℃煎煮1 h后，过滤，收集滤液。残渣加入15倍量蒸馏水（w∶v=1∶15），130 ℃煎煮0.5 h 后，过滤。合并两次滤液并浓缩至所需浓度，冷藏备用。

1.3.7 抗炎实验

1.3.7.1 小鼠分组及给药 昆明种小鼠60 只，雌雄各半，按体质量随机分为空白对照组、生品组、醋制品组、酒制品组、奶制品组和阳性对照组（阿司匹林肠溶片）。每组10 只，连续灌胃给药7 天，每日1 次。镰形棘豆给药组给药剂量为1.5 g/kg（以生药计），给药体积为20 mL/kg；阳性对照组治疗阿司匹林，0.2 g/kg；空白对照组给予等体积蒸馏水。给药期间小鼠自由饮水进食。

1.3.7.2 醋酸扭体实验 于末次给药30 min后，每只小鼠腹腔注射1.0 %冰醋酸溶液10 mL/kg，5 min 后记录15 min 内的扭体反应次数，并计算药物对扭体反应的抑制率。

扭体抑制率（%）=（空白对照组平均扭体次数-给药组平均扭体次数）/空白对照组平均扭体次数×100%

1.3.7.3 二甲苯致炎小鼠 耳肿胀实验末次给药30 min后于小鼠右耳正反两侧均匀涂抹二甲苯50 μL，左耳作对照，致炎1 h后脱颈椎处死，于左右耳同一部位用直径7 mm 的打孔器打下耳片，用电子天平称耳片重，以两耳片质量差为肿胀度，计算出肿胀度及耳肿胀抑制率。

肿胀度=右耳耳片质量-左耳耳片质量

肿胀抑制率（%）=（对照组肿胀度-给药组肿胀度）/对照组肿胀度×100%

1.3.8 毒性实验

1.3.8.1 毒性实验预实验 昆明种小鼠50 只，雌雄各半，按体质量随机分为空白对照组、生品组、醋制品组、酒制品组、奶制品组，每组10只。空白对照组给予蒸馏水、给药组给予15 g/kg（以生药计）剂量药液单次灌胃，给药体积为20 mL/kg，密切观察8 h 内反应，并连续观察14 天。记录各动物的中毒表现（如外观、行为、饮食、排泄物等）、毒性反应出现及恢复时间以及死亡情况等。实验期间无动物死亡，给药组及空白对照组动物均未见明显中毒表现，体质量均呈增长趋势，给药组与同期空白对照组无显著差异。

1.3.8.2 14 天毒性实验 昆明种小鼠50 只，雌雄各半，按体质量随机分为空白对照组、生品组、醋制品组、酒制品组、奶制品组，每组10只。连续灌胃给药14天，每天1次，给药剂量为15 g/kg（以生药计），给药体积为20 mL/kg，空白对照组给予等体积蒸馏水，于末次给药后12 h小鼠禁食禁水，24 h摘眼球采血，血样室温静置2 h后，离心半径：10 cm，3000 r/min 离心15 min，分离血清，用于血清生化指标AST、ALT、BUN、CRE 和LDH 的检测。迅速取肝、肾组织，用生理盐水清洗后用滤纸吸干，称定质量，用于计算脏器比；肝、肾组织迅速固定于组织固定液中，用于制作组织切片。组织切片HE 染色由武汉塞维尔生物有限公司制作完成。

1.4 统计学方法采用SPSS 19.0 统计学软件分析实验数据，计量资料符合正态分布以±s 表示，多组间数据比较采用单因素方差分析，方差齐性实验数据采用LSD 检验。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 镰形棘豆生品及各炮制品总黄酮含量镰形棘豆经过炮制，除醋制品外，总黄酮含量均有所升高，生品与各炮制品总黄酮含量由高到低依次为：奶制品＞酒制品＞生品＞醋制品。见表1。

表1 镰形棘豆不同制品中总黄酮及生物碱平均含量比较（±s） mg/g

表1 镰形棘豆不同制品中总黄酮及生物碱平均含量比较（±s） mg/g

样品生品醋制品总黄酮平均含量20.78±0.13 20.13±0.15生物碱平均含量0.090±0.0013 0.086±0.0012生物碱平均含量0.103±0.0014 0.091±0.0004样品酒制品奶制品总黄酮平均含量21.72±0.12 24.01±0.17

2.2 镰形棘豆生品及各炮制品总生物碱含量镰形棘豆经过炮制，总生物碱含量均有所降低，其中奶制品降低更为明显。总生物碱含量由高到低依次为：生品＞醋制品＞酒制品>奶制品。见表1。

2.3 醋酸扭体反应镰形棘豆各组和阳性对照组小鼠扭体次数均明显减少，与空白对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05）；扭体反应抑制率由高到低排序依次为：阳性对照（阿司匹林）＞奶制品＞酒制品＞生品＞醋制品。见表2。

表2 各组小鼠醋酸致扭体反应及二甲苯致耳肿胀实验比较（±s）

表2 各组小鼠醋酸致扭体反应及二甲苯致耳肿胀实验比较（±s）

注：与空白对照组比较，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01；-表示无数值

组别空白对照组生品组醋制品组酒制品组奶制品组阳性对照组鼠数10 10 10 10 10 10醋酸致扭体实验15 min内扭体次数（次）31.4±7.2 24.9±5.7*25.8±3.5*23.5±5.2**21.5±5.3**20.2±5.9**肿胀抑制率（%）-36.97 28.59 33.59 34.01 44.01扭体抑制率（%）-20.7 17.8 25.2 31.5 35.7二甲苯致耳肿胀实验二甲苯剂量（g/kg）-1.6 1.6 1.6 1.6 0.2肿胀度（mg）14.20±5.30 8.95±3.44**10.14±3.83*9.43±2.97*9.37±5.61*7.95±4.32**

2.4 二甲苯致耳肿胀实验结果镰形棘豆各组和阳性对照组小鼠耳肿胀度均明显减少，与空白对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05）；肿胀抑制率由高到低排序依次为：阳性对照（阿司匹林）＞生品＞奶制品＞酒制品＞醋制品。见表2。

2.5 小鼠体质量，肝、肾脏器指标镰形棘豆给药组肝脏指数、肾脏指数均稍有升高。其中，肝脏指数升高奶制品＜酒制品＜生品＜醋制品，肾脏指数除生品升高较为明显外，其余炮制品几乎与空白对照组无差异，各组数据差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

表3 各组小鼠体质量与肝、肾脏器指标比较（±s）

表3 各组小鼠体质量与肝、肾脏器指标比较（±s）

组别空白对照组生品组醋制品组酒制品组奶制品组鼠数10 10 10 10 10体质量（g）31.01±3.87 32.68±1.97 31.42±3.74 31.74±2.88 31.51±3.20肾脏指数（%）1.15±0.12 1.22±0.22 1.15±0.17 1.18±0.14 1.16±0.14肝重（g）1.28±0.18 1.43±0.17 1.42±0.24 1.36±0.29 1.31±0.27肝脏指数（%）4.13±0.25 4.35±0.29 4.53±0.64 4.24±0.64 4.13±0.55肾重（g）0.36±0.06 0.40±0.08 0.37±0.09 0.38±0.07 0.37±0.08

2.6 血液生化指标与正常对照组比较，镰形棘豆各给药组均能引起AST、ALT的显著升高（P＜0.01）。与镰形棘豆生品组比较，炮制品可降低AST、ALT水平，其中酒制品、奶制品降低AST 水平具有显著性差异（P＜0.05）。镰形棘豆生品引起小鼠血清LDH、BUN水平升高，而各炮制品BUN、LDH水平有所降低。镰形棘豆各给药组均能引起小鼠血清CRE的升高，生品组CRE 升高显著（P＜0.01），炮制品CRE 升高不显著。与生品组比较，各炮制品组的CRE 水平降低，其中酒制品、奶制品水平降低有显著性差异（P＜0.05）。见表4。

表4 各组小鼠血清生化指标比较（±s）

表4 各组小鼠血清生化指标比较（±s）

注：与空白对照组比较，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01；与生品组比较，#表示P＜0.05，##表示P＜0.01

组别空白对照组生品组醋制品组酒制品组奶制品组CRE（U/L））33.00±6.66##41.78±6.92**38.67±8.03 34.87±6.25#33.91±7.58#鼠数10 10 10 10 10 AST（U/L）124.12±25.95##223.26±23.81**203.64±43.45**187.93±28.88**#194.42±44.82**#ALT（U/L））49.50±6.75##69.36±11.28**65.18±6.74**64.86±13.55**64.77±7.93**LDHU/L））1101.02±217.28 1236.88±160.07 1059.72±178.63#980.99±160.00##946.82±127.88##BUN（mmol/L）8.23±1.40 8.50±0.92 7.76±1.35 7.76±1.03 7.49±0.86

2.7 病理组织学观察空白对照组小鼠肝索排列规律，肝小叶结构完整。镰形棘豆生药组肝索结构不清楚，肝脏细胞体积变大，大小不一致，出现气球样变，肝血窦增宽。与生药组相比，各炮制组小鼠肝脏病变范围减小，细胞炎症反应减轻。空白对照组小鼠肾脏组织结构基本正常，无明显病理变化。镰形棘豆生药组肾小管上皮细胞可见轻微空泡变性，肾小球萎缩，分界不清，各炮制组肾脏组织变性程度略有减轻。见图1。

图1 各组小鼠肝、肾组织病理学组织图（HE，×200）

3 结论

镰形棘豆含有多种生物活性成分，药用价值显著，是一种具有广泛应用前景的藏药［6］，但是随着近年来中药中毒事件的发生，其毒性也备受关注。中药炮制技术是否能够在不损害其药效的前提下，降低镰形棘豆的毒性值得探讨。传统的中药减毒炮制多以醋、酒为主要的炮制辅料。除此以外，藏药典籍中独特的奶制方法，对苦马豆素等生物碱类毒性成分也有良好的减毒作用［7］，故本研究选取了醋、酒、奶为辅料。为了突出炮制辅料的单一因素，在炮制品的制备过程中，仅炮制辅料不同，其他炮制时间、温度、干燥方式等均相同。

研究表明，镰形棘豆黄酮类化合物的生物学活性最为广泛，是发挥抗炎作用的主要成分［8］。前期研究表明，镰形棘豆总黄酮的抗炎效果优于单一黄酮成分，故以总黄酮含量作为抗炎活性的检测指标。生物碱被认为可能是该植物毒性活性的主要成分［4，9］，具体是哪种单一成分尚无定论，故以总生物碱含量作为毒性成分的检测指标。

镰形棘豆经过炮制，除醋制品的总黄酮含量稍有下降外，酒制品和奶制品的总黄酮含量略有升高，其他研究也发现酒制、奶制的炮制方法可以有效提高活性成分总黄酮的含量［10］，可能与辅料渗透能够增加黄酮类化合物的溶出度有关［11］。炮制品的总生物碱含量较之生品均有所降低，表明镰形棘豆经过炮制可降低镰形棘豆的毒性成分。

镰形棘豆给药组的扭体次数较空白对照组明显降低，证明镰形棘豆有良好的抗炎作用。其中，奶制品、酒制品灌胃小鼠扭体次数显著降低，生品与醋制品次之。镰形棘豆用药组能够显著抑制小鼠的耳肿胀，生品的耳肿胀抑制率优于各炮制品，差异并无统计学意义，可能是因为除黄酮类化合物外，镰形棘豆还存在其他具有抗炎作用的有效成分，炮制减损了其他抗炎有效成分的含量。

本研究在大剂量小鼠连续灌胃给药14 天后发现，与空白对照组相比，镰形棘豆生品组小鼠血清AST、ALT、LDH的水平升高，AST、ALT水平升高显著，说明大剂量长期服用镰形棘豆生品水煎液可能会引起肝损害。与生品组相比，各炮制品给药组小鼠血清AST、ALT、LDH 水平降低，酒制品、奶制品AST、LDH 水平降低显著，提示酒制品、奶制品可降低肝损害程度。镰形棘豆生品与各炮制品总生物碱含量差异并不明显，但生品造成的肝损伤较各炮制品有显著差异，原因可能是中药的肝毒性不是单一因素引起的，而是多种相互作用机制共同作用的结果［12］。与空白组对照组相比，生品组小鼠血清CRE显著性升高，各炮制品组CRE升高不显著。与生品组相比，各炮制品给药组小鼠血清的CRE 水平降低，醋制品降低不显著，酒制品、奶制品降低有显著差异，说明镰形棘豆炮制品对肾脏的损害低于生品。

综上所述，本研究发现镰形棘豆经过炮制后，均能达到“减毒存效”的目的，效果以奶制品为最优，酒制品次之。为了更加符合用药习惯，本研究采用镰形棘豆水提液灌胃进行小鼠实验，只是大致筛选了3 种炮制品的抗炎效果和毒性作用，对于单一药效或毒性成分在炮制前后发生的变化并不明晰，不能阐述“减毒存效”的炮制机制，有待进一步研究。