子宫内膜异位症关键基因与相关治疗中药的生物信息学分析∗

顾凤群，李卫红，宁 敏，覃 婷

广西中医药大学，广西 南宁 530200

子宫内膜异位症（Endometriosis，EMs）是一种复杂的妇科疾病，影响5%～10%的育龄期女性，可引起长期的慢性盆腔痛、痛经、性交困难及盆腔器官功能障碍，还可干扰内分泌影响卵巢功能，降低生殖能力［1-3］。目前，EMs的发病机制尚未明确，但研究发现，与子宫内膜具有相似生物学特征的异位内膜组织在腹腔侵入、种植并发生周期性出血，可起局部持续的炎症性反应，而持续的炎症促进内膜的黏附种植及血管生成［4］。此外，EMs患者血清、腹腔液和异位病灶中的细胞因子存在异常的免疫炎症反应［5-7］，因此，免疫-炎症反应被认为是EMs 发生发展的重要机制。目前治疗EMs 主要以改善症状为主，手术治疗复发率极高。

根据EMs 的症状及体征，可归属于中医学“不孕”“癥瘕”“痛经”“妇人腹痛”等范畴。因EMs 患者血液呈高黏稠性、异常的微循环及血流动力学改变，与中医血瘀的特征相似，故瘀血是EMs 的病理状态。近代医家以活血消癥法治疗EMs 取得良好的疗效，如化瘀消癥中药汤可有效抑制异位囊肿，缓解内膜异位症疼痛，改善患者的症状［8］。补肾祛瘀方可改善EMs 患者的盆腔微循环，促进血流运行，减轻患者疼痛［9］。本研究从GEO数据库筛选EMs 的表达谱芯片，运用生物信息学技术挖掘参与EMs 发病机制的关键基因、通路以及作用于关键基因的miRNAs，最后预测治疗EMs 的有效中药成分，为中医药治疗EMs提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 资料来源数据集GSE25628［10］来源于NCBI的GEO（gene expression omnibus）数据库，基于GPL571 平台（HG-U133A_2）Affymetrix Human Genome U133A 2.0 Array。该芯片含有22人子宫内膜组织样本的基因表达谱数据集，包括6 例正常健康的子宫内膜样本，16例异位子宫内膜组织。

1.2 DEGs的筛选运用在线工具GEO2R（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/）对数据集GSE25628 进行差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs）筛选，把数据集中没有注释的探针及重复对应多个基因的探针删除，筛选标准为adj.P.Val＜0.01，log FC＞2或log FC＜2，并将探针名称转化为标准基因名称，将筛选出的DEGs的差异表达情况用热图进行直观展示。

1.3 基因功能富集和注释使用metascape（https：//metascape.org/）数据库对DEGs 进行GO 功能富集和KEGG 通路富集分析。GO 富集包括分子功能（molecular function，MF）、生物学过程（biological process，BP）及 细 胞 组 分（cell component，CC），并将结果进行可视化。利用京都基因和基因组百科全书（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路数据库进行信号通路的富集，寻找差异表达基因所富集的关键通路并将结果可视化。

1.4 差异表达基因的相互作用分析对DEGs 进行蛋白互作网络构建及分析，STRING 数据库（https：//string-db.org/）和Cytooscape 软 件是用来构建蛋白-蛋白互作（protein-protein interaction，PPI）网络的主要工具。首先使用STRING 11.0 对DEGs 构建蛋白互作关系对，选取combined score＞0.4（中等可信度）的蛋白互作关系对导入Cytoscape 3.7.0 软件进行网络可视化。在PPI网络中，利用cytoHubba插件选择最大相关标准（matthews correlation coefficient，MCC）中的基因作为hub基因。

1.5 在ToppGene数据库检索DEGs相关miRNADEGs在体内表达水平发生异常变化可能诱导疾病的发生，在真核生物体内，基因表达水平主要受转录后调控。miRNA 可通过靶向mRNA 的3'UTR（3'untranslated regions）区抑制mRNA 翻译或使其发生降解从而发挥转录后调控作。在ToppGene 数据库（https：//toppgene.Cchmc.org/）检索靶向关键基因的miRNA。参数设定值：1）Correction，FDR；2）P-Value cut off，0.05；3）Gene Limts，1≤n≤2000；4）Source，MiRNA.org。

1.6 预测治疗EMs的有效药物比较毒物遗传学数据库（comparative toxicogenomicsdatabase，CTD），筛选关键基因的候选药物CTD 数据库（http：//ctdbase.org/），整合了多种生物的重要数据，可提供关于基因与化合物之间相互作用的信息，是进行药物筛选的重要工具。在CTD 数据库中，导入关键基因筛选出对这些关键基因具有潜在作用的化合物作为EMs的潜在治疗药物。

2 结果

2.1 GO 功 能 富 集 分 析DEGs 采 用metascape 对49 个DEGs 进行GO 功能富集分析（P＜0.05），DEGs主要涉及端粒维护、超分子纤维组织的调节、ERBB2 信号通路、蛋白质聚合的调控等生物过程，介导细胞黏附分子结合、激酶活性等分子功能，主要富集于细胞质核区、锥体、双链断裂的站点；DEGs 主要富集于癌症通路、PI3K-Akt 信号通路、细胞凋亡等经典通路。GO 和KEGG 富集分析显著性如1图所示

2.2 EMs 相关DEGs 的 筛 选GSE25628 数 据 集 中筛选到49 个DEGs，其中上调5 个，下调44 个。利用热图可直观显示出DEGs 表达水平变化主要以下调为主，如图2。

图2 GSE25628热图，红色代表上调基因，蓝色代表下调基因

图3 Hub基因的PPI

表2 关键基因筛选的潜在治疗药物

图1 A、B图为DEGs的GO功能富集，C图为DEGs的KEGG富集通路

2.3 DEGs 中Hub 基因的PPl采用Cytoscape 3.6.1 软件将PPI 网络可视化，利用cytoHubba 插件选择最大相关标准（MCC）中的前8 个基因作为hub 基因，分别为ATRX、SMC5、TPR、HSP90AA1、HI‐RA、RAD50、CEP290、PIK3R1，节点颜色越深代表分值越高，提示与EMs的发生发展越密切相关。

2.4 与关键基因相关的miRNA预测分析PPI 网络中筛选的关键基因均属于下调基因，可能是导致EMs发病的重要因素。利用ToppGene数据库检索到与上述关键基因相关的miRNAs 有84 个，miRNAs 可能通过作用于不同的关键基因的3'UTR区产生负调控作用，选取与关键基因相关联最显著的前十个miRNAs。

2.5 EMs治疗的候选药物筛选结果在CTD药物数据库中检索能够减少关键基因表达的药物，即可能对EMs 具有潜在治疗效果的药物，根据每个药物对应关键基因数目进行排序，前4 种植物药分别是植物提取物、木黄酮、白藜芦醇、槲皮素。

表1 关键基因对应miRNA的预测

3 讨论

EMs 是多因素疾病，为激素、免疫、雌激素、表观遗传及环境等因素共同作用所致，虽为良性，却有侵袭、黏附、转移、易复发等与恶性肿瘤相似的特性。研究表明，激素失常、内分泌失调导致一个持续性的炎症微环境，异位微环境能聚集多种细胞产生抗炎细胞因子，促进子宫内膜异位组织血管的生成、组织黏附和侵袭［11-12］。异位组织可能分泌免疫调节蛋白（如细胞间黏附分子-1）干扰腹腔免疫监视，使反流的子宫内膜逃过吞噬和清除，从而在腹腔种植生长。异位病变组织还可增加生长因子（如神经生长因子、转化生长因子-β）和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表达，可促进异位组织附近神经和毛细血管的募集，为增殖的异位内膜提供充足的血液营养［13］。此外，研究发现异位细胞抗凋亡、自噬参与EMs 发展过程的始终，可能与腹腔长期炎性环境有关，具体生理病理机制仍未明确［14-15］。本研究从GSE25628 数据集筛选到49 个DEGs，其中有44 个上调DEGs，对DEGs 进行富集功能分析，DEGs 主要涉及端粒维护、超分子纤维组织的调节、ERBB2 信号通路、蛋白质聚合的调控等生物过程，介导细胞黏附分子结合、激酶活性等分子功能，主要富集于细胞质核区、锥体、双链断裂的站点；DEGs 主要富集于癌症通路、PI3K-Akt 信号通路、细胞凋亡等经典通路。其中酪氨酸激酶受体2又称人表皮生长因子受体2可调控细胞生长、增殖、分化和凋亡。DEGs 富集于癌症相关通路，与EMs 具有与癌症相似的生物学特征相符，并且流行病学发现，子宫内膜异位症增加了卵巢癌发生的风险，它可能是透明细胞和子宫内膜异位卵巢癌的前体病变［16］。在月经周期中，内膜细胞凋亡增加可维持细胞平衡，促进成熟细胞脱落排出体外，研究发现细胞凋亡率降低可能激活NF-κB 通路，使异位内膜细胞大量增殖，从而导致EMs 的发展［17］。

筛选的关键基因为ATRX、SMC5、TPR、HSP90AA 1、HIRA、RAD50、CEP290、PIK3R1。ATRX 是一种染色质重塑复合物，也是表观遗传调控因子，可以调控与肿瘤进展相关的信号通路。研究发现在缺失ATRX 的细胞中转化生长因子β2、黏蛋白16（mucoprotein16，MUC16）和CXC 型趋化因子（c-xcmotif chemokine ligand 8，CXCL8）的表达显著上调，MUC16 编码的癌胚抗原125（carbohydrate antigen 125，CA125）是经典的肿瘤标志物，ATRX介导MUC16 的低表达可抑制异位细胞的聚集、黏附、迁移及侵袭性，导致细胞凋亡，从而抑制它们的增殖。CXCL8基因编码白细胞介素8，不仅能够促进血管生成，激活转移相关的基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs），还可以改变细胞凋亡的相关通路［18］。热休克蛋白90α家族A类成员1（heat shock protein 90 alpha family class a member 1，HSP90AA1）是广泛存在于真核细胞中的高度保守的分子伴侣，参与细胞生长、发育、分化、基因转录，参与肿瘤细胞的增殖分化，促进肿瘤组织血管生成和转移。研究发现，HSP90AA1可以通过调节VEGF表达诱导肿瘤血管生成，促进肿瘤的增殖和转移［19］。TPR（translocated promoter region）是一种保存的核孔复合物（nuclear pore complex，NPC）蛋白质，它包含几个盘绕的线圈结构域，其最初的N-末端部分被证明能够形成二聚体［20］。TPR 被证明在许多核过程中发挥作用，即调节mRNA 输出［21］，作为信号蛋白的支架元件，参与调节有丝分裂过程［22-23］。双链断裂修复蛋白（double strand break repair protein，RAD50）存在于细胞核中，是维持染色体结构稳定的重要蛋白，能够与双链断裂修复核酸酶形成MRN复合体，在识别DNA双链断裂损伤并修复的过程中发挥着重要的作用。研究发现，有RAD50 基因表达的肿瘤血管更少，因此RAD50 被认为是抑制肿瘤生长的重要靶点。PI3K 是由一个催化亚基（P110）和一个调节亚基（p85α）组成的二聚体酶，p85α 是由磷脂酰肌醇-3-激酶，调节亚单位1（PI 3 Kinase p85 alpha，PIK3R1）编码的。AI等［24］研究证实敲除PIK3R1 基因可抑制了细胞的迁移，促进细胞系的凋亡。降低PIK3R1 的表达会损害B 细胞发育和增殖，延缓胚胎发育和抑制细胞黏附［25］，PIK3R1 还可以通过PI3K/AKT 信号参与了细胞的的迁移和侵袭［26］。SUDA 等［27-28］研究发现，PIK3R1 在子宫内膜异位症中反复发生突变，与细胞增殖、侵袭和减少凋亡有密切关系。

在人类子宫内膜异位症中，细胞增殖和细胞周期调控基因也受到不同miRNAs 的调控。REKKER 等［29］研究表明，子宫异位内膜间质细胞miR-139-5p的miRNA是广泛上调的；miR-183涉及细胞生长、细胞分化、凋亡、细胞活力、细胞黏附和细胞入侵的调节［30-31］。HSP90 为miR-628-3p 的潜在靶基因，miR-628-3p 通过抑制HSP90 的表达促进异位内膜细胞凋亡，从而抑制异位内膜的迁移、侵袭［32］；miR-103、miR-107 已被证明可以抑制细胞增殖，调节脂质代谢和炎症［33-34］；miR-147 是巨噬体炎症反应的负稳压器，研究表明miR-147 参与一个负反馈回路，能够抑制巨噬细胞对多个TLR 配体的抗炎反应［35］。上述研究表明，通过干预调控不同基因的miRNAs 的表达，可抑制异位内膜细胞的侵袭、转移，促进其凋亡。

近年来，中医药治疗EMs 疗效显著，中医药干预EMs 的发病机制亦成为研究热点。祝燕莉等［36］研究发现，内异方可通过调控相关通路明显改善EMs 的炎症微环境，抑制异位内膜的浸润、黏附、侵入，达到治疗EMs 的目的。张亚萍等［37］研究发现，蠲痛饮通过下调PI3K/Akt/mTOR 通路蛋白的表达，抑制上皮间质细胞活性，促进异位内膜细胞的凋亡。可见，研究中药的主要成分对治疗EMs具有重要的临床意义。本研究中木黄酮属于植物雌激素，通过与雌激素-β受体的选择性相互作用来影响细胞功能，从而调控下游信号［38］。研究表明，木黄酮具有抗炎和抗血管生成作用，主要通过抑制脂多糖诱导的促炎细胞因子的表达和释放来抗炎，也可以通过抑制血管内皮生长因子的表达或分泌来抗血管生成［39-40］。SUTRISNO 等［41］研究表明，木黄酮能调节雌激素受体α 和雌激素受体β，抑制子宫内膜异位症小鼠腹腔炎症和血管生成。白藜芦醇是一种植物性多酚，具有抗动脉粥样硬化、抗癌、抗血管生成、抗氧化、抗炎等特性，通过抑制环氧合酶的合成，抑制促炎细胞因子的合成和释放，抑制活化的免疫细胞，从而抑制前列腺素的合成，同时也可抑制促血管生成因子VEGF 和MMPs，抑制血管内皮细胞和平滑肌细胞的增殖和迁移，从而发挥其抗癌和抗动脉粥样硬化的作用［42-43］。OZCAN 等［44］研究表明，白藜芦可明显缩小子宫内膜异位组织，降低子宫内膜异位植入物的VEGF表达及腹膜液和血清血管内皮生长因子A和单核细胞趋化蛋白1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）趋化因子的水平，还可抑制子宫内膜细胞的增殖、侵袭，促进其凋亡［45］。白藜芦醇通过抑制VEGF 基因的表达和合成而发挥抗血管生成作用，并可能通过其抗炎作用抑制细胞因子诱导的MCP-1 在各种培养组织和免疫细胞中的表达、合成、分泌、受体活性和趋化活性，从而改善EMs 腹膜内微环境［46-47］，达到治疗EMs 的目的。PARK 等［48］研究了槲皮素对人子宫内膜异位症细胞抗增殖和促凋亡的作用，结果表明，槲皮素可通过细胞周期停滞有效抑制细胞增殖，通过DNA 片段化诱导细胞凋亡，并伴有线粒体膜功能障碍和活性氧的产生。此外，槲皮素使ERK1/2、P38 和PI3K 信号蛋白磷酸化失活，抑制两种细胞系的增殖。

综上所述，本研究从GSE25628 芯片筛选影响EMs 发病的关键基因、通路及调控关键基因作用于EMs 的miRNAs，最后预测治疗EMs 的中药有效成分，为进一步研究EMs 的发病机制提供新的思路，也为中医药治疗EMs 的有效性提供理论依据，但本研究后续进行相关实验的验证。