球孢白僵菌对草地贪夜蛾的毒力及组织病理学研究

李兆英,欧阳恺昱,胡 叶,颜 菁,仝雨欣,易 好

(陕西学前师范学院生命科学与食品工程学院,陕西 西安 710100)

草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)属鳞翅目(Lepidoptera)夜蛾科(Noctuidae),是重要的农业害虫,食性杂、分布广、适应性和迁飞能力极强。其幼虫主要以玉米、小麦、水稻、甘蔗等多种农作物为食,从2019年在我国云南首次发现后,现已扩散至我国的大部分省市,给农业生产造成了巨大的损失[1]。

为了有效防治草地贪夜蛾,国内研究者进行了大量的工作。鲁艳辉等比较了氯虫苯甲酰胺等6种不同化学杀虫剂对草地贪夜蛾幼虫的生物活性[2],为草地贪夜蛾的化学防控提供了参考。但是因为化学农药对环境的影响以及草地贪夜蛾的抗性提高[3],更多的研究者在尝试使用生物防治,如天敌昆虫[4]、昆虫病原线虫[5]、病原微生物[6-7]等。

球孢白僵菌(Beauveriabassiana)简称为白僵菌,属于丝孢类昆虫病原真菌,致病性强,寄主范围极其宽泛,现已广泛应用于各种农林害虫,如玉米螟(Ostriniafurnacalis)[8]、棉铃虫(Helicoverpaarmigera)[9]等的防治,并取得了良好的防治效果。白僵菌可以通过接触昆虫的体壁、节间膜、气孔等侵染宿主,也可以在昆虫进食、呼吸时,通过消化道、呼吸道等内部途径侵入[10]。在适宜的温度和湿度条件下,白僵菌分生孢子分泌各种胞外酶,并借助机械压力穿透宿主体壁,进入体腔形成菌丝[11];菌丝依赖昆虫血腔中的养分不断地生长、繁殖,并侵染昆虫的脂肪体、肌肉以及消化、呼吸系统等各个组织、器官;此外菌丝在生长过程中还会分泌各种毒素以及代谢产物,造成昆虫的生理及代谢功能紊乱,最终死亡[12]。

本研究通过室内毒力测定以及石蜡切片和HE染色技术,研究白僵菌对草地贪夜蛾的毒力以及致病机理,为使用生物农药白僵菌防治草地贪夜蛾以及明确病原真菌同昆虫宿主之间的相互作用机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试菌株及昆虫

供试球孢白僵菌购自盐城市神威微生物菌种科技有限公司(8089508)。可湿性粉剂有效成分含量为200亿孢子/g。供试草地贪夜蛾为室内人工饲养,饲养条件为温度26±1 ℃,相对湿度70%～80%。

1.2 试验方法

1.2.1 菌液制备

将称量好的1 g球孢白僵菌粉刮入含有19 mL 0.05% Tween-80润湿剂和100 mL蒸馏水的三角瓶中,在恒温(26 ℃)磁力搅拌器上充分振荡10～30 min,待分生孢子粉被完全打散后,用滴管吸取少量菌液滴入血球计数板中,测定孢子浓度,然后按照比例稀释配制成1.0×106、1.0×107、1.0×108、1.0×109孢子/mL的孢子悬浮液。

1.2.2 球孢白僵菌对草地贪夜蛾的毒力测定

选取体型一致,生长健康且活动正常的3龄幼虫200头,集中称重后计算平均体重,并测量体长,放入5个已加有饲料的虫盒中,每个虫盒40头。将配置好的4种不同浓度的菌液均匀喷施于4个虫盒中的虫体及饲料上。对照虫盒中不喷施菌液。所有处理均置于适合白僵菌生长的温度(26±1 ℃)下,对照和各处理均重复3次。每隔24 h测量试虫的体重和体长,并记录幼虫死亡数量、存活数量和死亡日期。

1.2.3 组织切片

取40头健康草地贪夜蛾3龄幼虫,置于加有饲料的虫盒,喷施1.0×108孢子/mL菌液。每隔24 h观察幼虫症状,并选择感染症状明显的试虫5头,立即用多聚甲醛4 ℃固定过夜。梯度酒精75%、80%、90%、95%和100%脱水;二甲苯透明;石蜡包埋;横向连续切片,切片厚度7 μm,切片裱于涂有多聚赖氨酸的载玻片上,烘干备用;切片脱蜡后复水,苏木精、伊红染色;显微摄影系统(Leica DM750)观察拍照。

1.3 数据统计方法

生物测定数据采用SPSS27.0统计软件进行数据统计分析,应用one-way ANOVA方差分析进行差异显著性检验。采用Excel软件绘制图形,计算死亡率、校正死亡率。

死亡率(%)=死亡虫数/处理总虫数×100

校正死亡率(%)=(处理死亡率-对照死亡率)/(1-对照死亡率)×100

进行回归分析,建立毒力回归模型,分别计算剂量效应致死中浓度LC50值、致死中时间LT50值和相关系数(R)等参数。

2 结果与分析

2.1 球孢白僵菌侵染草地贪夜蛾幼虫的毒力测定

从表1可以看出,球孢白僵菌对草地贪夜蛾的杀虫活性同孢子的浓度有关。因浓度为1.0×106孢子/mL的球孢白僵菌孢子悬浮液对草地贪夜蛾幼虫的死亡率几乎无影响,故未列出。而浓度为1.0×107和1.0×108孢子/mL的白僵菌在第6 d后对草地贪夜蛾幼虫的死亡率>50%;第9 d时,草地贪夜蛾幼虫的校正致死率>95%。其中1.0×109孢子/mL的幼虫死亡率低于其它两个浓度处理。分析LT50发现,1.0×108孢子/mL致死时间最短。综合死亡率还是致死时间分析,1.0×108孢子/mL的杀虫效果最佳;而1.0×107孢子/mL的杀虫效果同1.0×108孢子/mL接近;但是最大浓度(1.0×109孢子/mL)菌液的杀虫效果并不理想。

表1 不同浓度球孢白僵菌对草地贪夜蛾3龄幼虫的室内毒力

从表2可以看出,随着处理时间的延长,LC50值呈下降趋势,接菌后5～7 d,LC50值由1.4×109孢子/mL 降低到8.1×106孢子/mL,第9 d的LC50值仅为5 d时的0.32%。

表2 球孢白僵菌对草地贪夜蛾3龄幼虫的致死中浓度

由图1可以看出,除菌液浓度为1.0×106孢子/mL处理的草地贪夜蛾3龄幼虫,其在发育早期(3～5 d),体重和体长略大于正常个体外,其余幼虫的体重和体长均小于正常个体。其中,高浓度菌液(1.0×109孢子/mL)对个体的发育影响尤其明显,其体重和体长都显著小于正常个体;处理2～3 d后,幼虫体色发黑、僵硬,对触碰反应迟钝,发育基本停滞。

图A,B中数据为平均数±标准误,柱上不同小写字母表示经LSD法检验在0.05水平差异显著。图1 草地贪夜蛾3龄幼虫平均体重(A)和平均体长(B)随接种时间变化图

2.2 球孢白僵菌侵染草地贪夜蛾幼虫的组织病理学变化

正常草地贪夜蛾的体壁由表皮层(cuticle)、真皮细胞层(epidermis)和基膜(basement membrane)组成,表皮层较薄,分层不明显(图2,B)。体壁下的脂肪体呈带状,脂肪体细胞略呈方形,排列整齐,胞核椭圆形;体壁肌由排列整齐的平行肌纤维组成(图2,A,B);中肠圆筒形,其结构由外向内可分为纵肌(longitudinal muscle)、环肌(circular muscle)、基膜(basement membrane)、肠壁细胞(epithelium,肠上皮)和围食膜(peritrophic membrane)。正常中肠肠壁结构完整,圆筒形的上皮细胞和杯状细胞排列整齐,纹状缘紧密而清晰;环肌和纵肌呈格子状排列,规则而连续(图2,A,C)。

A,B：健康草地贪夜蛾幼虫的组织结构;C：健康草地贪夜蛾幼虫中肠的组织结构;D,E：处理48 h草地贪夜蛾幼虫的组织结构;F,G,H：处理96 h草地贪夜蛾幼虫的组织结构;I：处理120 h草地贪夜蛾幼虫的组织结构;J：处理120 h草地贪夜蛾中肠的组织结构;K：处理144 h草地贪夜蛾幼虫的组织结构;L：处理144 h草地贪夜蛾中肠的组织结构.In：体壁;Cu：表皮;Ep：真皮;BM：基膜;IF：节间褶;Mu：肌肉;FB：脂肪体;Tr：气管;VNC：腹神经索;MT：马氏管;DBV：背血管;ME：中肠上皮;CM：环肌;LM：纵肌;PM：围食膜;SB：纹状缘;ML：肠腔;Sp：孢子;Hy：菌丝;Cy：包囊。图2 白僵菌侵染草地贪夜蛾3龄幼虫的组织病理变化

球孢白僵菌处理48 h后,可见大量的分生孢子附着在草地贪夜蛾幼虫的体壁表面(图2：D,E),但未见内部结构有明显变化(图2：D,E)。处理96 h后,菌丝突破表皮层,表皮层同真皮层分离,但是真皮细胞层和基膜依然连续(图2：F,G,H);幼虫会在体壁局部形成包囊,包裹真菌孢子(图2：G);体壁下的脂肪体以及气管、肌肉、中肠等组织结构完整,未见明显的组织病变(图1：H)。处理120 h后,幼虫的体壁褶皱、断裂,菌丝侵入体腔;壁脂肪体细胞分离;肌肉束松散(图2：I);肠道内有真菌孢子出现,中肠上皮细胞层同肌肉层分离,局部上皮细胞排列变得疏松,细胞变形、间隙增加,纹状缘脱落、变形;围食膜崩溃;马氏管变形、破裂(图2：J)。处理144 h后,体壁崩溃,菌丝充满体腔;壁脂肪体细胞空泡化;肌纤维松散、断裂(图1：K);中肠严重破坏,局部断裂,上皮细胞排列杂乱且从底膜脱落,细胞溶解并出现空洞(图2：L);试虫个体开始死亡。

3 结论与讨论

3.1 球孢白僵菌对草地贪夜蛾幼虫的毒力分析

球孢白僵菌侵染草地贪夜蛾3龄幼虫时,白僵菌的孢子首先附着在幼虫体壁表面,经过1～2 d的潜伏期,孢子萌发,大量孢子布满虫体表面,后侵入虫体。在侵染早期(1～2 d),幼虫会出现兴奋、触碰逃窜等行为,到3 d以后,幼虫虫体发黑,僵硬、卷曲,并失去活力,行动迟缓,进食量减少,生长变得缓慢;6 d左右,试虫开始死亡。

有研究表明,真菌在感染宿主时可能会遇到选择压力,因此会发展出操纵宿主行为的策略,如改变宿主的行为,包括取食行为、攻击性、行为方式、运动活跃度、趋向性等[13]。然而,宿主行为变化并不一定都对寄生者有益,这也可能是宿主为了降低感染的病理副作用而形成的适应[13]。推测草地贪夜蛾幼虫对不同浓度的菌液侵染采取不同的防御策略：对于较低浓度(1.0×106孢子/mL)的菌液,在处理早期(3～5 d),其幼虫体重和体长都会略微大于正常个体。分析其原因,可能是外来致病真菌的刺激,诱导了幼虫取食量的增加,导致幼虫试图通过加快生长发育速度,以增强抵抗力来降低侵害。而对于高浓度(1.0×109孢子/mL)的菌液,幼虫停止进食,也基本停止生长发育,进入类似蛰伏的状态,这种策略会导致侵入者的营养不足;同时过高的菌种密度,导致种群内对营养和空间的竞争加剧,繁殖力下降;此外,高密度的菌种产生的过量的代谢物,也会抑制种群数量的再增加,从而降低对宿主的侵害,使真菌的杀虫效率降低[14]。由此看来,在使用白僵菌来杀灭草地贪夜蛾时,要注意施用浓度：浓度过小,会刺激害虫引起应激反应,短期内增加取食量,加大危害力度;而浓度过大,则会刺激害虫进入蛰伏状态,且会造成菌种之间的竞争,降低杀虫效率。应该根据致病菌的特点,寻找合理的施用浓度,以达到较好的防治效果。本研究表明,球孢白僵菌的浓度为1.0×108孢子/mL时杀虫效果最好,推荐用于防治草地贪夜蛾。

室内毒力测定也表明,球孢白僵菌在适宜的条件下,分生孢子才更易于萌发和侵染,并表现出有效的毒力,其中湿度条件尤为关键,当湿度小于40%时,白僵菌的萌发效率明显下降。所以在田间应用时,最好选在雨后等空气湿度较大时喷施,效果最佳。当然,除了湿度之外,还应考虑到喷施时的温度、光照等多种不同环境因素,应根据各地的不同环境条件具体考量[15]。

3.2 球孢白僵菌侵染对昆虫幼虫体壁的影响

昆虫寄生真菌可通过体壁、节间膜、消化道、呼吸道等途径感染宿主,其中体壁是入侵的主要方式之一,而宿主体表的结构特征对昆虫真菌的侵染行为和致病性有着重要的影响[16]。昆虫成虫,其体壁大部分骨化,节间褶前有一条未骨化的膜质区——节间膜,成为体节之间的分界,而这里连同昆虫的足和头部,成为病原真菌体壁侵染的薄弱点[17]。王晓红等通过扫描电镜观察白僵菌侵染桑天牛Aprionagermari幼虫体表的过程发现,幼虫体表的节间膜成为白僵菌侵入的薄弱区[18]。本研究结果显示,因昆虫幼虫和成虫体壁构造的差异,幼虫相邻体节之间的环形凹陷,即节间褶(intersegmental fold)作为纵肌的附着点,表皮层会褶皱增厚,故这里并不利于真菌的侵入,而其侵入点一般会选在节间褶之间的平缓结构区里。此外,因幼虫头部的外骨骼高度几丁质化,白僵菌也很少从这里侵入。

在白僵菌对草地贪夜蛾幼虫的侵染过程中,在最初的两天内,白僵菌分生孢子大量聚集在幼虫体壁表面,没有观察到侵入的痕迹,幼虫体壁的表皮层对真菌起到了第一层阻隔的作用。到第4 d左右,白僵菌侵染并分解表皮层,进入表皮层和真皮细胞层之间,但是真皮细胞层和基膜完整而连续,对白僵菌起到了第二层阻隔的作用。真皮层和基膜很好地保护了幼虫体腔内的脂肪体、肌肉和中肠等结构,阻挡了真菌对内部脏器的损伤;同时,幼虫还形成了类似包囊的结构,包裹住真菌孢子,这些都明显延缓了真菌对草地贪夜蛾的侵染速度。

林华峰等的研究发现,白僵菌在浸染松毛虫Dendrolimuspunctatus时,会造成菌虫表皮层的分层现象,真菌最先侵入内表皮,而上表皮和外表皮的褶皱、断裂则是同体腔内脂肪体组织的变形、破裂以及肌肉的溶解同时发生[19]。但是在白僵菌侵染草地贪夜蛾体壁的过程中,并没有看到表皮层明显的分层现象,这可能是由于草地贪夜蛾的表皮层较薄,分层不明显的缘故。而且,白僵菌是在破坏了体壁结构后,才侵入体腔进而侵染中肠等内部结构。同样的现象也发生在白僵菌在对甜菜夜蛾幼虫体壁的侵染过程中,在处理的第3 d左右,真菌完全侵蚀了表皮层结构,并沿着表皮层区域形成了一层真菌带,随后开始侵染真皮层和基膜(数据未发表)。由此看来,白僵菌对于不同昆虫种类的侵染过程存在差异,这可能同昆虫体壁的厚度及结构差异有关,对于体壁较厚的昆虫,如松毛虫、蛴螬等,白僵菌会采用侵入钉(infection peg)的方式来突破坚硬的上表皮和外表皮,直接侵染表皮层中最软的结构——内表皮,进而侵染体腔内脏器;而对于如草地贪夜蛾以及甜菜夜蛾这样体壁较薄的种类,白僵菌会在破环了体壁结构后,再入侵体腔。此外,这种现象的产生可能也同前述的真皮层和基膜对白僵菌的第二层阻隔作用有关,对侵染上表皮和外表皮同侵染真皮和基膜所花费的时间、营养等成本的差异,也会影响白僵菌的侵染方式。

3.3 球孢白僵菌侵染对昆虫幼虫中肠的影响

中肠作为昆虫消化食物和吸收营养的主要场所,也成为各种微生物攻击的目标。本研究结果表明,通过体壁侵入的白僵菌会在大约第5 d左右侵染到中肠肌肉层,造成肠壁肌纤维的松散、分离,但是肠壁上皮细胞基本完好。到大约第6 d后,菌丝侵入肠腔内,肠壁细胞以及肌肉层受到严重破坏,中肠组织崩溃,试虫开始死亡。

研究表明,白僵菌在突破昆虫体壁或消化道壁屏障进入昆虫血腔后,以消耗宿主营养、干扰代谢、分泌毒素及破坏宿主组织结构等方式引起宿主死亡[10]。但是真菌致死昆虫的主要原因,现在仍然存在争议。一些研究者认为,白僵菌的侵入对寄主的组织器官没有造成太大影响[20];但也有人认为,侵入者对宿主肌肉、脂肪体等的损伤是造成宿主死亡的主要原因[10]。本研究结果表明,白僵菌侵入草地贪夜蛾体壁后,对内部组织结构的影响随着其的蔓延程度逐渐展开,但是相较于对中肠组织结构的破坏程度,对脂肪体以及肌肉的影响较慢,且不明显,故认为白僵菌对草地贪夜蛾消化道的损伤是造成试虫死亡的主要原因。孙鲁娟和吴孔明在对白僵菌侵染棉铃虫H.armigera的研究结果也表明,在试虫死亡前,只有体壁及肠壁细胞发生较明显的病变,而其他大部分器官是在棉铃虫死亡后才遭到破坏的[21]。

昆虫的血淋巴对进入体内的病原物会产生免疫反应,其免疫机制主要有血细胞的吞噬、成瘤和包被作用以及经诱导产生抗菌肽的杀菌作用,但是它们的防御机制并不能有效地抑制真菌的生长。同时侵入血淋巴的病原真菌可能会因为昆虫血腔内部的天然防御反应,优先入侵宿主的消化道,所以在实验中可观察到受感染的昆虫幼虫出现摄食抑制等现象,尤其是高浓度的真菌感染。同时,这也是宿主为了降低真菌的侵染力以及感染的病理副作用而形成的适应性反应。但是,随着时间的延长,宿主的生理应激(饥饿、营养消耗和入侵真菌产生毒素等)以及防御机制会逐渐失效,最终导致宿主死亡[22]。

病原真菌同宿主之间的相互作用、相互斗争是一个漫长而复杂的过程,对于病原真菌对昆虫的致病机理已有研究,但是还有许多问题迄待解决。对于白僵菌对草地贪夜蛾致病机理的深入研究,既可为草地贪夜蛾的防治提供科学依据,也可为进一步挖掘白僵菌的应用潜能提供参考。