多光谱法探究壳聚糖与酪蛋白的结合作用

康柱，闫焕，周素珍,2,3，范金波,2,3

（1.渤海大学 食品科学与工程学院，辽宁 锦州 121013；2.辽宁省食品安全重点实验室，辽宁 锦州121013；3.生鲜农产品贮藏加工及安全控制技术国家地方联合工程研究中心，辽宁 锦州 121013）

壳聚糖（Chitosan，CS）作为天然生物大分子多糖，因具有特殊的氨基结构，故性质稳定[1]。CS 可作为食品保鲜剂应用在果蔬保鲜、肉制品保鲜以及水产保鲜[2-5]；作为食品添加剂起到增稠、澄清的作用[6-7]，还具有调节机体免疫力，改善胃肠道等功能[8-9]；除此之外，在食品包装上也有所应用[10-11]。因此，CS在食品领域的研究与开发具有广阔的前景。

酪蛋白（Casein，CA）是牛乳中含量最丰富的蛋白质[12]，其含有多种必需氨基酸，具有较高的营养价值[13]。因其具有良好的乳化性、保水性、溶解性和发泡性，已被成熟应用于肉制品、烘焙食品、人造奶油、干酪、饮料等食品的加工中[14]。除此之外，还可用作蛋白基载体来运输药物或多酚、黄酮类生物活性小分子[15]。

食品中添加多糖较为常见，多糖的添加不仅可以改善食品品质、风味，还可以延缓食品变质，延长货架期[16-19]。乳制品货架期一直是消费者关注的焦点，徐佳等[20]研究表明在乳饮料中添加少量黄原胶、β–葡聚糖等，可改善产品口感和外观，增强稳定性，延长货架期。Zielinska 等[21]研究表明将低聚果糖添加在发酵乳制品中，可提高该产品的感官黏度和质量，从而延长贮藏期。目前，在乳制品中多糖的应用较为广泛，但对研究CA–多糖相互作用机制及机理的报道较为少见，且CA–多糖的相互作用易受到pH、离子强度、电荷密度等因素影响[17]。因此，本文选用牛乳中含量最高的CA 与在食品领域应用广泛的CS 为研究对象，在3 种不同pH 值（7.4、5.2、3.0）条件下，探究CS 与CA 的结合作用，以及对CA 结构的影响，这对乳制品的贮藏和开发研究具有重要意义。

1 实验

1.1 材料与试剂

主要材料与试剂：酪蛋白（98 %），北京索莱宝科技有限公司；壳聚糖（分子质量≈30 000 u，纯度≥95%），酷尔化学科技（北京）有限公司；其他实验试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

主要仪器与设备：F–7000 荧光分光光度计，日本日立高新技术公司；IRTracer–100 傅里叶变换红外光谱仪，岛津企业管理（中国）有限公司；PHS–25 pH计，仪电科学仪器（上海）股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 储备液的配制

称取一定量的酪蛋白和壳聚糖，配制2 mg/mL 的CA 储备液和8 mg/mL 的CS 储备液（溶于体积分数为1%的乙酸溶液），配制浓度为0.2 mol/L 的磷酸缓冲液。

1.3.2 荧光光谱

1.3.2.1 荧光光谱测定

向离心管中加入一定量的PBS 缓冲液，再加入30 μL CA 溶液，最后加入CS 溶液，使之充分反应30 min。最终离心管中体系的总体积为3 mL，CA 的质量浓度为0.02 mg/mL，CA 与CS 浓度比为1 ∶0、1 ∶9、1 ∶18 、1 ∶27 、1 ∶36 、1 ∶45 （6 个不同浓度比在图中分别以1—6 表示）。在298 K 和310 K 温度下，设置激发波长为280 nm，狭缝宽度为5.0 nm，扫描范围为290～500 nm 内的荧光发射光谱[22]，并在3 种不同pH 值（7.4、5.2、3.0）条件下进行测量。

1.3.2.2 荧光猝灭机理和结合常数计算

本实验采用Stern–Volmer 方程（1）和Hill 方程（2）分析荧光猝灭机理[23]。

式中：F0和F为未加入和加入CS 时CS 的荧光强度峰值；[Q]为CS 在体系中浓度；τ0为荧光团的平均寿命（10−8s）；Ksv为猝灭常数；Kq为生物分子猝灭速率常数；Ka为表观结合常数。

1.3.2.3 热力学性质分析

通过Van't Hoff 方程（3）和热力学方程（4）计算相关参数，分析其作用力类型[24]。

式中：R为气体常数，R=8.314 J/(mol·K)；K1和K2为对应T1、T2的表观结合常数；ΔG为结合反应的吉布斯自由能变化；ΔS为熵变。

1.3.3 同步荧光光谱测定

样品配制方法同1.3.2.1 节，参考郝明皓[25]方法并做修改，在298 K 温度下，设置激发波长和发射波长间隔Δλ=60 nm 和Δλ=15 nm，测定样品在250～350 nm范围内同步荧光光谱。分别在3 种不同pH（7.4、5.2、3.0）条件下进行测量。

1.3.4 三维荧光光谱测定

固定CA 质量浓度为0.02 mg/mL，CS 质量浓度为0.36 mg/mL，设定激发波长为200～350 nm，发射波长为200～450 nm，在298 K 温度下，进行三维荧光光谱的测定[25]。分别在3 种不同pH（7.4、5.2、3.0）条件下进行测量。

1.3.5 傅里叶变换红外光谱测定

样品溶液配制方法同1.3.2 节，参考张超等[26]的方法，将反应完全的样品通过真空冷冻干燥制成粉末状固体，分别称取待测样品和KBr，使待测样品和KBr 质量比约为1 ∶100，混合均匀并进行充分研磨，制成待测薄片；放入傅里叶变换红外光谱仪中，设置扫描范围为400～4 000 cm−1，进行光谱扫描并记录。

1.4 数据处理

实验均重复3 次，实验数据表示为平均值±标准差；实验数据采用IBM SPSS Statistics 21 软件进行处理，使用Origin 2022 软件进行绘图。

2 结果与分析

2.1 荧光光谱分析

如图1 所示，在不同条件下，CS 对CA 均产生荧光猝灭效应，且在340 nm 附近出现荧光最大吸收峰。在298 K 时，3 种pH 条件下，CA 的荧光强度峰值分别降低了57.5%、61.9%和58.1%；当pH=7.4时，最大发射波长（λmax）发生微弱的红移；pH=5.2时，λmax红移6 nm（335～341）；pH=3.0 时，λmax发生红移4 nm（336～340）。在310 K 时，CA 的荧光强度峰值分别降低了59%、61.7%和59.7%，且均发生红移；在相同pH 条件下，与298 K 相比较，λmax也发生轻微的变化。这说明pH 的变化，使二者相互作用的微环境发生改变，同时温度也改变了二者发生反应的微环境。由图1g、h 可知，随着CS 浓度的逐渐升高，猝灭率也随之增大，且pH=5.2 时猝灭率最高。

图1 pH 对CS 与CA 相互作用影响的荧光光谱Fig.1 Fluorescence spectra for the effect of pH on the interaction between chitosan on casein

2.2 荧光猝灭机理和结合常数

本文通过分析荧光猝灭机理，探究CS 与CA 之间的相互作用。荧光猝灭类型包括动态猝灭和静态猝灭，2 种方式均可以降低CA 的荧光强度[27-28]。本文采用方程（1）和方程（2）计算，并分析CS 与CA相互作用的荧光猝灭机理[29]。

由表1 可知，在同一pH 值条件下，在CA 中加入CS，Ksv与温度呈现负相关关系，但Kq均大于最大散射碰撞猝灭常数（2×1010M−1·s−1），说明CS 对CA 产生静态猝灭，且二者结合形成新的复合物。在pH=5.2 时，猝灭常数Ksv最大，与图1g、h 的结果一致。由Hill 方程计算出来的结合常数Ka都在103数量级，说明CS 与CA 的结合能力较强。在不同pH条件下，n均在1 左右，这表明CA 结构中至少有一个结合位点与CS 相结合[30]，与前人的研究结果相一致[26]。R2的值越接近于1，说明数据越精确。

表1 CS 与 CA 相互作用的常数Tab.1 Constants for the interaction between chitosan and casein

2.3 热力学性质分析和作用力类型

当生物大分子与小分子相互作用时，主要通过氢键、范德华力、静电相互作用等作用力相连接[31-32]。本文通过Van't Hoff 方程（3）和热力学方程（4）来分析其反应的热力学性质和作用力类型[33-34]。

由表2、3 可知，ΔG<0，ΔS>0 说明CS 与CA 结合均为熵增加的自发反应。当pH=7.4 和pH=3.0 时，ΔH<0，说明在这2 个pH 条件下，该反应为放热反应，与表1 中随着温度升高Ka减小相呼应。由此可推断在此pH 条件下，静电相互作用为主要驱动力；在pH=5.2 时，ΔH>0，二者反应为吸热反应，可推断出二者通过疏水相互作用结合，与前人结果相一致[26]。在pH=5.2 时，热力学常数的方向发生变化，且pH=5.2更接近于CA 的等电点。由此可推断pH 值的变化影响了CA 与CS 结合的微环境。

表2 CS 与CA 相互作用的热力学参数Tab.2 Thermodynamic constants for interaction between chitosan and casein

表3 热力学常数与相互作用力的关系Tab.3 Relationship between thermodynamic constants and interaction forces

2.4 同步荧光光谱的分析

同步荧光光谱通过对荧光团氨基酸残基——酪氨酸（Tyr）和色氨酸（Trp）的微环境变化进行分析，判断蛋白质构象是否发生改变[35]。在同步荧光光谱中，Tyr 的微环境变化在Δλ=15 nm 处，Trp 的微环境变化在Δλ=60 nm 处[36]。本文通过同步荧光光谱中λmax的偏移情况，判断CA 构象是否发生改变。

如图2 所示，在pH=7.4 时，Tyr 和Trp 残基的λmax均发生轻微红移，说明对应氨基酸残基附近暴露的微环境的亲水性增强；当pH=5.2 时，λmax未发生明显变化；当pH=3.0 时，Trp 残基的λmax红移4 nm，这反映出Trp残基附近的微环境极性增强，更容易在环境中暴露；而Tyr 残基的λmax没有发生偏移。以上结果可推测出CS的存在和pH 值共同使CA 的构象发生了变化。

图2 温度为298 K 时，CS 与CA 相互作用的同步荧光光谱Fig.2 Synchronous fluorescence spectra of interaction between chitosan and casein at 298 K

2.5 三维荧光光谱分析

三维荧光光谱与荧光发射光谱相比，对CA 的荧光强度和峰的信息展示更全面、更直观。其中峰a 表示Trp 残基的光谱特征峰，峰b 反映的是CA 多肽骨架光谱变化[37]。

由图3 可观察出，当CS 加入后，峰a 和峰b 的荧光强度都发生了不同程度的降低。由表4 可知，加入CS 后，当pH=7.4 时，Trp 残基的光谱特征峰a 的λmax蓝移6 nm，荧光强度降低4.54%，峰b 的λmax红移3 nm，荧光强度降低了12.98%；当pH=5.2 时，峰a 的λmax蓝移5 nm，峰b 的λmax红移2 nm，荧光强度分别降低了17.72%和40.20%；当pH=3.0 时，峰a的λmax蓝移4 nm，峰b 的λmax红移4 nm，荧光强度分别降低6.75%和29.05%。pH=5.2 时猝灭效果最强，与前文发射荧光光谱中的结果相一致。以上结果表明在不同pH 条件下，与CA 三维荧光光谱相比，加入后CS，峰a 均发生明显蓝移，蛋白荧光基团残基微环境的非极性增强，且峰b 均发生不同程度红移，反映出蛋白荧光基团残基的微环境的亲水性增强。由此可推测，CS 的加入和pH 值的影响，使得CA 的构象发生改变。

表4 CA 和CA–CS 的三维荧光特征参数Tab.4 Three-dimensional fluorescence characteristic parameters of casein and casein-chitosan

图3 温度为298 K 时，CS 与CA 相互作用的三维荧光光谱Fig.3 Three-dimensional fluorescence spectra of interaction between chitosan and casein at 298 K

2.6 傅里叶变换红外光谱分析

傅里叶变换红外光谱可用来进一步研究蛋白质二级结构的变化。通常根据光谱中酰胺Ⅰ带（1 700～1 600 cm−1）和酰胺Ⅱ带（1 600～1 500 cm−1）的偏振情况，分析出蛋白质结构的变化，从而进一步说明蛋白质与配体发生了相互作用[38]。也可通过光谱中的酰胺A 带（3 400～3 300 cm−1）的改变来辅助说明[39]。

由图4 可知，CA 在酰胺Ⅰ带和酰胺A 带有较明显的特征吸收峰。在pH=7.4 的条件下，CA 与CS 发生作用后，酰胺Ⅰ带的峰位从1 688.94 cm–1偏移到1 653.49 cm–1；同时酰胺A 带的峰位从3 445.72 cm–1偏移到3 433.98 cm–1。pH=5.2 时，与pH=7.4 时相比，酰胺Ⅰ带的峰位从1 653.49 cm–1偏移到1 638.31 cm–1，且酰胺A 带也发生了偏移；当pH=3.0 时，酰胺Ⅰ带的峰位发生偏移，酰胺A 带未发生偏移。以上结果表明CA 的结构在与CS 结合后发生了变化，同时pH 值的变化也会影响CA 与CS 结合后的构象。

图4 温度为298 K 时，CS 与CA 相互作用的傅里叶变换红外光谱Fig.4 FTIR spectra of interaction between chitosan and casein at 298 K

3 结语

本文通过荧光光谱法、同步荧光光谱法、三维荧光光谱法以及傅里叶变换红外光谱法探究CA 与CS的相互作用，以及CS 的加入对CA 产生的影响。研究结果表明，在3 种pH 条件下，CS 的加入，使CA产生荧光猝灭现象。通过对荧光猝灭机理和热力学分析可知，该猝灭类型属于静态猝灭，二者通过静电相互作用结合。在pH=5.2 时，猝灭效果最为明显，这可能与CA 的等电点有关。同步荧光光谱和三维荧光光谱表明，CS 的加入和pH 值的影响改变了CA 的空间构象；傅里叶变换红外光谱中酰胺Ⅰ带和酰胺A 带的偏振情况表明CA 的结构发生了变化。实验结果表明，CS 的加入使得CA 的结构发生变化，同时，pH值的变化也影响到了二者的结合。这将为蛋白质–多糖的相互作用提供实验依据，对乳制品的贮藏及开发具有重要意义。