负载蓝莓花青素的壳聚糖基智能指示膜监测花蛤新鲜度的研究

王欣，李停停，冯龙斐，张腾

（上海理工大学 健康科学与工程学院，上海 200093）

食品新鲜度指示型包装可以直观反映食品的品质及安全信息，是当前研究热点之一[1]。食品包装环境的pH 值与食品新鲜度密切相关[2]。花青素是一种来源广泛的水溶性可食用天然色素，随pH 值变化呈现明显的颜色变化，是一种理想的pH 敏感指示剂[3]。例如，蓝莓花青素已被用于监测牛肉[4]、牛奶[5]的新鲜度。菲律宾蛤仔（Ruditapes.philippinarum），俗称花蛤，是世界上主要的经济贝类之一。鲜活菲律宾蛤仔水分含量较高，易受体内微生物生长繁殖的影响而使新鲜度降低，导致样品中蛋白质的分解和挥发性盐基总氮（TVB–N）含量的增加[6]，因此，亟须对其新鲜度进行实时监测。

膜的基材对食品新鲜度指示型包装的构建也很重要。其中，来源广泛、生物相容性好、成膜能力高的壳聚糖是理想选择之一[7]。当然，为了改善单纯壳聚糖基薄膜力学性能较差的问题，研究者也尝试将壳聚糖和明胶共混以提高膜的物理性能[8]，或者通过添加多酚类、精油、多肽等天然生物活性化合物改善薄膜的物理及功能特性[9]。

本文以壳聚糖为基质，通过复合明胶、乳酸链球菌素（Nisin）、迷迭香精油和蓝莓花青素制备了5 种pH 敏感的壳聚糖基复合薄膜。在分析蓝莓花青素及复合薄膜的pH 敏感和颜色响应性的基础上，对膜材的微观结构、物理特性和功能特性等进行研究，并将较优的指示膜应用于花蛤冷藏过程中新鲜度的监测。

1 实验

1.1 材料与仪器

主要材料：壳聚糖（CS，脱乙酰度≥95%），上海麦克林股份有限公司；明胶（G），上海维塔有限公司；乳酸链球菌素（N），浙江新银象生物工程有限公司；迷迭香油（R），上海鼎芬化学科技有限公司；甘油，国药集团化学试剂有限公司；吐温–80、蓝莓花青素（ATH）、甲基红、溴甲酚绿，上海麦克林股份有限公司；花蛤，上海壹佰米有限公司。

主要仪器：85–2 型恒温磁力搅拌器，金坛市科析仪器有限公司；恒温恒湿培养箱，上海跃进医疗器械有限公司；C–400 型色差仪，日本Chroma Meter公司；UV–9100 D 紫外–可见分光光度计，北京莱伯泰科仪器股份有限公司；Synergy H4 多功能酶标仪，美国BioTek Instruments Inc.；TA.XT.Plus 型质构仪，英国Stable Micro System 公司；GeminiSEM 300 扫描电子显微镜，德国Carl Zeiss 公司；自动凯氏定氮仪，上海勇规分析仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 pH 敏感薄膜的制备

将一定质量的壳聚糖溶解在体积分数为1%的乙酸溶液中，得到质量分数为2%的CS 溶液。将一定质量的明胶在去离子水中浸泡10 min，然后50 ℃水浴搅拌30 min，得到质量分数为2%的明胶溶液（G）。将CS 溶液与G 溶液以2 ∶1 的体积比混合得壳聚糖–明胶（CSG）溶液。分别在100 mL 的CS 和CSG 溶液中加入0.8 g 的Nisin，搅拌均匀得到CSN 和CSGN溶液。将迷迭香精油与吐温–80 以1 ∶5 的质量比进行混合得乳化的精油，在100 mL 的CSN 和CSGN溶液中分别加入0.5 g 乳化的迷迭香精油，得到CSNR和CSGNR 溶液，每种溶液中都含有一定量的甘油（体积分数为5%）。最后向CS、CSN、CSNR、CSGN 和CSGNR 溶液（100 mL）中加入0.06 g 的蓝莓花青素，搅拌均匀后于室温下静置脱气。取10 g 成膜溶液倒入直径为9 cm 的培养皿中，在温度为40 ℃、相对湿度为 30%的条件下干燥 24 h，薄膜分别命名为CS–ATH、CSN–ATH、CSNR–ATH、CSGN–ATH 和CSGNR–ATH。取样分析前，所有薄膜在温度为25 ℃、相对湿度为50%下平衡48 h。

1.2.2 蓝莓花青素溶液的紫外光谱扫描

在Liu 等[10]的方法基础上作适量修改。取50 μL蓝莓花青素溶液（1 g/L）至5 mL 的pH 缓冲液中，混匀后使用紫外分光光度计扫描获得蓝莓花青素在不同pH 值（3～12）的缓冲溶液下的吸收光谱（波长范围为300～800 nm）。其中，缓冲液由0.2 mol/L的Na2HPO4、0.2 mol/L 的柠檬酸和0.2 mol/L 的NaOH溶液混合制备而成。

1.2.3 智能指示膜在不同pH 值缓冲溶液中的颜色响应

将5 种薄膜剪切成方形（2 cm×2 cm），在pH 值为3～12 的缓冲溶液中浸泡10 min 后取出，去除薄膜表面多余的缓冲溶液，在固定光源下拍照记录薄膜的颜色变化。

1.2.4 膜的表征

1.2.4.1 厚度

使用数显千分尺测定样品的厚度，在薄膜上随机取10 个点进行测量，最后计算平均值。

1.2.4.2 透过率和不透明度

将薄膜裁剪成1 cm×4 cm的长方形，在300～800 nm扫描范围内测量薄膜（20 mm×40 mm）的透过率（T）。薄膜的不透明度（O）根据式（1）进行计算。

式中：A600为薄膜在600 nm 处的吸光度；d为薄膜厚度，mm。

1.2.4.3 水分含量和水溶性

薄膜的水分含量根据Shen 等[11]的方法修改后测定。薄膜（20 mm×20 mm）于室温下称量后，在105 ℃下干燥24 h 后再次称量。根据式（2）计算样品薄膜的水分含量（M）。

将上述干燥脱水后的样品浸泡于蒸馏水（25 mL）中，在25 ℃下振摇24 h 后再次在105 ℃下干燥24 h后称量。根据式（3）计算薄膜的水溶率（S）。

式中：m1为干燥前的质量；m2为干燥后的质量；m3为浸泡后的质量。

1.2.4.4 力学性能

应用质构仪测定薄膜的拉伸强度（TS）和断裂伸长率（EB）。用千分尺测量薄膜厚度后，将长方形薄膜（33 mm×22 mm）用夹具固定；输入样品的长度、宽度和厚度后，以3.33 mm/s 的拉伸速度进行测试，每组样品重复6 次。

1.2.4.5 扫描电子显微镜观察

应用扫描电子显微镜（GeminiSEM 300）分析薄膜的表面和横截面形貌。将薄膜样品在液氮中冷冻破碎后喷金镀膜，然后置于样品台，并在10.0 kV 的加速电压下观察薄膜的表面和横截面形貌。

1.2.4.6 抗氧化特性

DPPH 自由基的清除能力的测量方法是在Chen等[12]的方法基础上稍作修改。以壳聚糖添加量为基础，将样品稀释至0～5 mg/mL。取2.0 mL 样品和2 mL DPPH 无水乙醇溶液（0.4 mmol/L）混合，摇匀后于25 ℃避光孵育30 min，在517 nm 处测量吸光度，根据式（4）计算DPPH 自由基清除率（RDPPH）。

式中：A0为2 mL DPPH 自由基（乙醇）溶液与2 mL 无水乙醇反应后的吸光度；A1为2 mL DPPH 自由基（乙醇）溶液与2 mL 样品反应后的吸光度；A2为2 mL 样品与2 mL 无水乙醇反应后的吸光度。

ABTS 自由基的清除能力的测量方法在Wu 等[13]的方法基础上稍作修改。将7.0 mmol/L 的ABTS 溶液与2.45 mmol/L 过硫酸钾溶液混合得到7 mmol/L的ABTS 储备液，使用前在室温下避光反应12～16 h。ABTS 储备液用甲醇稀释，使其在734 nm 处的吸光度为（0.700±0.020）。测定时将1 mL 样品和4 mL 的ABTS 储备液充分混合，振荡30 s 后避光孵育6 min，于734 nm 处测定吸光度，以上实验均以抗坏血酸（VC）为阳性对照。根据式（5）计算ABTS 自由基清除活性（RABTS）。

式中：A3为4 mL ABTS 自由基溶液与1 mL 去离子水反应后的吸光度；A4为4 mL ABTS 自由基溶液与1 mL 样品反应后的吸光度；A5为4 mL 样品与1 mL去离子水反应后的吸光度。

1.2.4.7 抗菌特性

以纸片扩散法分析薄膜溶液的抗菌性能[14]。6 mm定性滤纸片于5 mL 棕色玻璃瓶中灭菌干燥后，在无菌条件下分别将5 种薄膜溶液注入棕色瓶中。以无菌水为阴性对照，浸泡1 h（按每个纸片饱和吸水量为500 μL 计）。分别取300 μL 菌液浓度为108CFU/mL的溶藻弧菌（V.alginolyticus）、副溶血性弧菌（V.parahaemolyticus）、金黄色葡萄球菌（S.aureus）和大肠杆菌（E.coli）等菌液进行平板涂布，静置3～5 min后，用无菌镊子将制备好的纸片紧贴于琼脂平板表面。在37 ℃下倒置培养12 h，以直尺十字交叉法测量抑菌圈直径，读取整毫米数，无明显抑菌作用的记作滤纸片大小（6 mm）。抑菌作用判定标准：抑菌圈直径≥20 mm，高度敏感；抑菌圈直径为[12,20)mm，中度敏感；抑菌圈直径为[7,12)mm，弱敏感；抑菌圈直径<7 mm，不敏感。

1.2.4.8 鲜活花蛤的新鲜度监测

选择性能较佳的薄膜应用于鲜活花蛤新鲜度的监测。挑选可对外界刺激作出迅速响应的鲜活花蛤（60±0.2）g，置于PE 盒中，将指示膜（2 cm×2 cm）贴于PE 盒盖的内壁，然后用聚丙烯薄膜密封。在4 ℃下保藏5 d，每天测定样品的TVB–N 含量和pH 值。其中，TVB–N 含量测定参照GB 5009.228—2016 中的自动凯氏定氮仪法，pH 值参照GB 5009.237—2016中的方法进行测定[15]。

1.2.5 统计分析

利用SPSS 21.0 对数据进行ANOVA 方差分析。采用 Duncan 多重极差检验评价差异的显著性（P<0.05 为显著性差异）。采用Origin 8.0 软件进行数据分析、图表及图谱分析处理。

2 结果与分析

2.1 蓝莓花青素溶液的紫外光谱扫描

蓝莓花青素在不同pH 值缓冲溶液下的颜色变化和紫外–可见光谱如图1 所示。随pH 值由3 增加至6，红色溶液逐渐变浅；pH 值为7～10 时，溶液颜色变为紫红色，随pH 值的增大逐渐加深；在pH值为10～11 时，溶液颜色变浅；而在pH 值为12 时溶液变为深黄绿色。当pH 值＜5 时，溶液在510 nm处存在特征吸收峰，随着酸度的增加，吸光度逐渐降低。pH 值为7 时，特征吸收峰右移至550 nm 处。pH 值为7～10 时，特征吸收峰出现在580 nm 处，且吸光度增加。当pH 值为11～12 时，580 nm 处的吸光度逐渐降低。这种颜色变化、吸收峰及吸光度的变化与花青素在不同的pH 条件下的结构转变有关。Alizadeh-Sani 等[16]发现，花青素在强酸性条件下主要以呈红色的黄翁阳离子存在，在510 nm（pH 值为3）附近产生特征吸收峰，随着酸性减弱，花青素失去氢质子，主要以无色的甲醇假碱形式存在，吸光度降低，吸收峰红移。pH 值为6～10 时，阴离子醌碱开始产生，吸收峰进一步红移，吸光度增加。最后，在强碱溶液中（pH 值为11～12）花青素被降解，吸光度降低且峰值消失[17]。

图1 蓝莓花青素在不同缓冲溶液中的UV–vis 光谱及颜色变化Fig.1 UV-vis spectra and color changes of blueberry anthocyanins in different buffer solutions

2.2 复合薄膜对pH 的颜色响应

图2 为5 种薄膜在不同pH 缓冲溶液中的颜色变化。从整体来看，薄膜在pH 值为3～5 时整体偏红色，随酸性的降低红色逐渐变浅；当pH 值为6～7 时薄膜颜色逐渐变为蓝色/绿色；当pH 值为7～10 时，随pH 增大蓝绿色薄膜颜色逐渐加深；当pH 值为11～12时颜色向黄绿色转变。GSNR–ATH 膜的颜色变化更为明显，而CS–ATH 膜的颜色整体偏暗。当pH 值小于7 时，CSGN–ATH 和CSGNR–ATH 膜的颜色为浅粉色，区分度较小。

图2 不同薄膜在pH 值为3～12 的缓冲溶液中的颜色变化Fig.2 Color change of different films in buffer solutions of pH 3-12

2.3 厚度

厚度与膜的物理性能（如力学性能、水蒸气渗透性和透光率等）密切相关。图3 为5 种薄膜厚度的变化。

图3 不同薄膜样品的厚度Fig.3 Thickness of different film samples

由图3 可知，CS–ATH 薄膜的厚度为0.064 mm，而CSN–ATH、CSNR–ATH、CSGN–ATH、CSGNR–ATH膜的厚度显著增大（P<0.05）。这是由于膜的厚度一般与成膜制剂中的固体浓度成正比。CSNR–ATH 膜厚度最大，为0.103 mm；CSN–ATH 与CSGN–ATH膜的厚度相似，分别为 0.092 mm 和0.096 mm；CSGNR–ATH 膜厚度较小，为0.083 mm。

2.4 透光率和不透明度

紫外–可见光阻隔性能是评价食品包装阻碍紫外–可见光能力的重要指标。如图4 所示，5 组薄膜均表现出较强的紫外光阻隔性能，薄膜在600 nm 处的透光率从大到小依次为 CSNR–ATH、CSN–ATH、CS–ATH、CSGN–ATH、CSGNR–ATH。花色苷独特的官能团使其具有强烈吸收紫外线的能力[18]。壳聚糖–明胶薄膜阻光性较高，可能是由于明胶能够均匀分散在壳聚糖基质中形成网络结构，透射光在壳聚糖–明胶聚合物界面处会发生光的散射或反射[19]。

图4 不同薄膜的UV–vis 光吸收光谱和透光率Fig.4 UV-vis light absorption spectra and transmittance of different films

由图5 可知，与透光率结果一致，CSNR–ATH的不透明度（1.45 mm–1）显著低于其他4 组薄膜的，而CSGN–ATH 不透明度最高（2.47 mm–1）。薄膜中添加的天然颗粒改变了聚合物之间的相容性，从而表现出不同的不透明度[20]。有研究表明，花青素的添加会对壳聚糖复合物复杂的空间结构产生破坏作用，导致光散射和反射，增加了不透明度[18]。总体而言，5种薄膜均具有一定抵御紫外线的潜力。

图5 不同薄膜样品的不透明度Fig.5 Opacity of different film samples

2.5 水分含量和水溶性

由图6 可知，CS–ATH 膜水分含量最高，为69.02%；其次为CSGN–ATH 和CSGNR–ATH 膜，水分含量分别为66.60%和67.22%；CSN–ATH 膜的水分含量降低至63.76%；CSNR–ATH 膜的水分含量最低，为61.27%。平衡水分含量高不仅与制备工艺有关，还与壳聚糖、明胶和甘油的亲水性有关[10]。CSN–ATH 膜水分含量较低可能是由于壳聚糖的氨基与乳酸链球菌素中的羧基结合生成酰胺键，释放出水分子，形成氢键[21]，从而减少了壳聚糖基质无定形区域中水和聚合物之间的氢键[22]。此外，精油也可通过氢键作用限制多糖与水之间的相互作用，降低水分含量。

水溶性是反映薄膜耐水性和稳定性的重要参数。图6 表明，5 组薄膜的水溶性范围为70.98%～82.88%。与单纯壳聚糖薄膜的水溶性（20.00%±0.30%）相比[23]，CS–ATH 膜的水溶性高达74.78%，这可能是由于壳聚糖和花青素之间相互作用导致吸水的亲水位点数量增加[24]。CSN–ATH（82.88%）与 CSGN–ATH（80.83%）的水溶性都相对较高，而CSNR–ATH 膜的水溶性最低，说明迷迭香油的添加显著改变了薄膜的水溶性[25]。

2.6 质构特性

拉伸强度（TS）和断裂伸长率（EB）可以反映食品包装的机械阻力和柔韧性。由图7 可知，薄膜成分显著影响膜的力学性能（P<0.05）。CS–ATH 膜的拉伸强度为2.70 MPa，断裂伸长率为76.02%，添加Nisin 后，CSN–ATH 膜的拉伸强度和断裂伸长率显著增大（P<0.05）。这可能是由于乳链球菌肽通过氢键与壳聚糖连接增加了分子间交联的数量，使薄膜结构更加稳定[26]。含有明胶的CSGN–ATH 薄膜的拉伸强度和断裂伸长率则低于CSN–ATH 薄膜的。这可能是因为CS 与明胶溶液混合后得到的CSG 溶液的pH 值相对增大，使Nisin 在CSG 溶液中的溶解度降低，且Nisin 的添加阻碍了壳聚糖和明胶之间的相互作用，使得CSGN–ATH 薄膜力学性能降低[27]。加入迷迭香精油后，CSNR–ATH 和CSGNR–ATH 薄膜的拉伸强度和断裂伸长率也低于CSN–ATH 和CSGN–ATH 薄膜。这是因为疏水性精油的存在导致生物聚合物在重排时形成了不均匀的膜网络和不连续的微观结构，使得机械阻力下降[28]。CSGN–ATH 组的断裂伸长率高于CSNR–ATH 膜的，表明与迷迭香精油相比，明胶的添加可以增加薄膜的断裂伸长率。这是因为明胶的羟基能够插入壳聚糖链之间，从而降低分子内和分子间的结合，有助于增加壳聚糖链之间的距离，提高薄膜的延伸性[29]。

图7 不同薄膜样品的力学性能Fig.7 Mechanical properties of different film samples

2.7 SEM

由图8 可知，薄膜形态受添加成分的影响且粗糙度不同。CS–ATH 膜具有连续、均匀和相对光滑的表面（图8a）以及致密的内部结构（图8f）。而CSN–ATH膜表面（图8b）的粗糙度略有增加，但横截面（图8g）微观结构仍光滑且规则。CSGN–ATH 膜表面（图8d）具有一些光滑区域和一些粗糙区域，可观察到裂纹和褶皱，这可能与膜基质内花青素与壳聚糖和明胶成分之间的相互作用有关。从CSNR–ATH（图8c）和CSGNR–ATH 膜（图8e）的表面图像可观察到明显的粗糙及褶皱断裂。同时，CSNR–ATH（图8h）和CSGNR–ATH 膜（图8j）的横截面图像有空腔存在，这可能是迷迭香精油的疏水性造成的[30]。

图8 不同薄膜样品的扫描电子显微镜图像Fig.8 Scanning electron microscope images of different film samples

2.8 薄膜的抗氧化特性

图9 为薄膜对DPPH 和ABTS 自由基的清除活性的测定结果。图9表明，在CS的质量浓度为0～5 mg/mL时，5 种薄膜溶液对ABTS 自由基的清除率高于对DPPH 自由基的清除率。这可能是由于DPPH 溶解在乙醇溶液中，而有机溶剂不容易与亲水性聚合物相互作用，从而抑制活性成分的释放。Ezati 等[31]用甲醇DPPH 溶液也得到了类似的结果。5 种薄膜溶液的抗氧化能力随样品溶液浓度的增加而增强，如图9a 所示。在质量浓度为5 mg/mL 时，VC、CS、CSN、CSNR、CSGN 和CSGNR 薄膜溶液对DPPH 自由基溶液的清除率分别为50.41%、14.15%、10.65%、15.54%、61.33%和69.66%。含有精油的CSNR 和CSGNR 薄膜溶液对DPPH 自由基的抗氧化活性显著提高，这是由于迷迭香精油中含有大量具有抗氧化作用的酚酸和萜类化合物[32]。Gómez–Estaca 等[33]研究表明，明胶中的肽对自由基有一定的清除能力。图9b 中，当CS 的质量浓度为5 mg/mL 时，VC、CS、CSN、CSNR、CSGN 和CSGNR 薄膜溶液对ABTS 自由基的清除率分别为99.00%、45.72%、90.95%、81.93%、78.00%和79.00%。表明添加Nisin、明胶和迷迭香精油后显著提高了复合薄膜对ABTS 自由基的清除能力。

图9 薄膜溶液的抗氧化特性Fig.9 Antioxidant properties of film solution

2.9 薄膜溶液的抗菌特性

5 种薄膜溶液对V.alginolyticus、V.Parahaemolyticus、S.aureus和E.coli的抗菌活性如图10 所示。5 种薄膜溶液对V.alginolyticus的抑菌效果均不显著（抑菌圈小于7 mm），但CS 薄膜溶液对V.Parahaemolyticus的抑菌圈直径为（8.61±0.96）mm，显著大于其他4 种薄膜溶液（P<0.05）对V.Parahaemolyticus的抑菌圈直径。带正电荷的壳聚糖可以作为阳离子的螯合剂，破坏细菌细胞壁的完整性[34]，或通过静电相互作用与细胞膜上脂多糖的阴离子部分结合，从而导致细胞死亡[35]。CSN、CSNR、CSGN、CSGNR等4 种复合薄膜溶液对金黄色葡萄球菌均有显著的抑菌效果，而CSGN 和CSGNR 溶液的抑菌效果低于CSN 和CSNR 溶液的，说明明胶的加入削弱了薄膜溶液的抑菌效果。这是因为带负电荷的明胶中和了壳聚糖的正电，从而导致溶液的抗菌活性减弱[8]。

图10 不同薄膜溶液对4 种菌株的抑制作用Fig.10 Inhibition of different film solutions on four strains of bacteria

2.10 花蛤的新鲜度监测

选择颜色变化明显和物理性能优异的CSNR–ATH膜进行鲜活花蛤的新鲜度监测，结果如图11 所示。图11a 中，在微生物和酶的作用下，冷藏过程中鲜活花蛤的新鲜度不断降低，蛋白质和氨基酸被分解为氨和胺类等挥发性碱性含氮物质，包装环境中的挥发性含氮物质及pH 值不断增加[36]。花蛤初始的pH 值为6.96，冷藏3 d 后，pH 值增大至7.31，在第5 天时增大至7.34。TVB–N 变化更为显著，花蛤初始的TVB–N含量为4.76 mg/100 g，此时图11b 中的膜为浅绿色。冷藏3 d 后，TVB–N 值显著增加至16.83 mg/100 g，此时膜的颜色转变为深绿色。根据GB 2733—2015《食品安全国家标准 鲜、冻动物性水产品》，贝类TVB–N 的新鲜临界值为15 mg/100 g，花蛤冷藏3 d时已超过不可食用的限值。第4 天时，TVB–N 值增加到23.53 mg/100 g，包装盒内产生明显腐败性气味，膜的颜色向黄绿色转变。第5 天时TVB–N 值达到25.92 mg/100 g，薄膜达到最终的黄绿色。结果表明，CSNR–ATH 膜可以有效反映鲜活花蛤在冷藏期间新鲜度的变化。

3 结语

以壳聚糖为基质，蓝莓花青素为pH 指示剂，通过复合明胶、Nisin 和迷迭香精油制备了5 种智能指示膜。经过对pH 敏感性、颜色响应性、微观结构、阻隔特性、力学性能、含水率、水溶性、抗氧化、抗菌等特性的比较，发现蓝莓花青素在不同pH 缓冲溶液中的颜色变化显著；CSNR–ATH 膜具有较好的紫外线阻隔能力、最低的水分含量和水溶性，且有较强的抗氧化能力和抗菌效果。以CSNR–AT 膜监测鲜活花蛤冷藏期间的新鲜度，发现随花蛤新鲜度的下降，该膜颜色变化明显且能反映TVB–N 含量的变化，表明CSNR–ATH 膜可以作为鲜活花蛤新鲜度的智能指示剂。