基于JAK2/STAT3信号通路探究调控miRNA-27a对肺结核大鼠的干预效果

吴海燕 林娟娟 戢晴 杨朝晖 徐红艳

[摘要] 目的 分析基于蛋白酪氨酸激酶2（janus kinase 2，JAK2）/信號转导因子和转录激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）信号通路探究调控微RNA（microRNA，miRNA）-27a对肺结核大鼠的干预效果。方法 选取50只雄性SPF级Wistar大鼠，采用随机数字表法选取10只大鼠作为对照组，另外40只建立肺结核模型，将建模成功的30只大鼠分为模型组（n=10）、沉默组（n=10）、过表达组（n=10）。对照组和模型组大鼠注射生理盐水，沉默组大鼠尾静脉注射10μl miRNA-27a沉默慢病毒悬液，过表达组大鼠尾静脉注射10μl miRNA-27a过表达慢病毒悬液。比较miRNA-27a表达量、结核分枝杆菌菌落数、γ干扰素（interferon-γ，IFN-γ）、白细胞介素6（interleukin-6，IL-6）、环氧化酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）表达水平，以及JAK2、STAT3 mRNA、JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3表达量水平。结果 与对照组相比，模型组miRNA-27a表达量降低，结核分枝杆菌菌落数、IFN-γ、IL-6、COX-2、TNF-α、JAK2、STAT3 mRNA、JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3表达量升高，差异均有统计学意义（P<0.05）；与沉默组相比，过表达组miRNA-27a表达量升高，结核分枝杆菌菌落数、IFN-γ、IL-6、COX-2、TNF-α、JAK2、STAT3 mRNA、JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3表达量降低，差异均有统计学意义（P<0.05）。结论 上调miRNA-27a表达，可改善肺结核大鼠体内菌落水平，使大鼠肺损伤减轻，其机制可能抑制JAK2/STAT3信号通路相关。

[关键词] 肺结核；蛋白酪氨酸激酶2/信号转导因子和转录激活因子3；微RNA-27a；干预效果

[中图分类号] R521      [文献标识码] A      [DOI] 10.3969/j.issn.1673-9701.2023.14.002

To explore the intervention effect of regulating miRNA-27a on pulmonary tuberculosis rats based on JAK2/STAT3 signaling pathway

WU Haiyan1， LIN Juanjuan2， JI Qing3， YANG Chaohui1， XU Hongyan1

1.Department of Infection， Taizhou First people's Hospital， Taizhou 318020， Zhejiang， China; 2.Department of Emergency， Taizhou Hospital of Zhejiang Province， Taizhou 317000， Zhejiang， China; 3.Department of Nephrology， Taizhou First Peoples Hospital， Taizhou 318020， Zhejiang， China

[Abstract] Objective To analyze the effect of the signal transducer and activator of transcription 3 （STAT3） signalling pathway based on janus kinase 2 （JAK2） on the regulation of microRNA （miRNA）-27a in rats with pulmonary tuberculosis. Methods A total of 50 male SPF-grade Wistar rats were selected. 10 rats were selected as the control group according to the random number table method， and the other 40 were used to establish a tuberculosis model. Totally 30 rats were successfully modelled and divided into model group （n=10）， silent group （n=10） and overexpression group （n=10）. The rats in the control and model groups were injected with saline， the rats in the silent group were injected with 10 μl of miRNA-27a silencing lentiviral suspension in the tail vein， and the rats in the overexpression group were injected with 10 μl of miRNA-27a overexpression lentiviral suspension in the tail vein. Compared miRNA-27a expression， mycobacterium tuberculosis colony count， interferon-γ （IFN-γ）， interleukin-6 （IL-6）， cyclooxygenase-2 （COX-2）， tumor necrosis factor-α （TNF-α） expression levels， as well as JAK2， STAT3 mRNA， JAK2， p-JAK2， STAT3， p-STAT3 expression levels. Results Compared with the control group， the model group showed decreased miRNA-27a expression and increased expression of mycobacterium tuberculosis colony number， IFN-γ， IL-6， COX-2， TNF-α， JAK2， STAT3 mRNA， JAK2， p-JAK2， STAT3， p-STAT3， all with statistically significant differences （P<0.05）. Compared with the silent group， the overexpression group showed increased expression of miRNA-27a， IFN-γ， IL-6， COX-2， TNF-α， JAK2， p-JAK2， STAT3， p-STAT3. The expression of miRNA-27a was increased and the expression of Mycobacterium tuberculosis colony number， IFN-γ， IL-6， COX-2， TNF-α， JAK2， STAT3 mRNA， JAK2， p-JAK2， STAT3， p-STAT3 was decreased in the overexpression group compared with the silencing group， and the differences were all statistically significant （P<0.05）. Conclusion Upregulation of miRNA-27a expression can improve colonization levels and reduce lung injury in rats with pulmonary tuberculosis by a mechanism that may be related to inhibition of the JAK2/STAT3 signaling pathway.

[Key words] Pulmonary tuberculosis; Protein tyrosine kinase 2/signal transducer and activator of transcription 3; MicroRNA-27a; Intervention effect

肺结核是由结核杆菌感染引起的慢性传染疾病，可导致患者免疫力减低、胸痛、咳嗽、四肢乏力，严重时可对其他器官造成损害，甚至威胁生命[1-2]。临床主要采用药物干预和化学治疗，但易出现用药不规律、治疗方案不合理等问题，导致患者出现耐药性，治疗效果受到影响[3-4]。故寻找新的生物学靶点较为重要。miRNA-27a为非编码单链RNA分子，可抑制脂多糖诱导的小胶质细胞炎症因子产生，减轻体内炎症反应，减少细胞凋亡[5]。蛋白酪氨酸激酶2（janus kinase 2，JAK2）/信号转导因子和转录激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）可對炎症反应进行调节，介导缺血再灌注后肺损伤的发生，抑制该通路的激活，可使大鼠肺组织炎症减轻，保护其肺组织[6]。因此，本研究基于JAK2/STAT3信号通路探究调控miRNA-27a对肺结核大鼠的干预效果进行分析，以明确miRNA-27a与肺结核的关系。

1  材料与方法

1.1  动物

选取50只雄性SPF级Wistar大鼠，体质量200～230g，购于导科医药技术（广东）有限公司［动物许可证号：SYXK（粤）2022-0273］。所有大鼠在相对湿度70%、室温25oC笼子中进行喂养，对所用水、食物进行高温高压杀毒，适应性喂养7d，本研究通过台州市第一人民医院伦理委员会审批（伦理审批号：2022-KY017-02）。

1.2  方法

1.2.1  miRNA-27a慢病毒载体构建  通过GenBanK查找获得LPL基因序列，构建miRNA-27a沉默、过表达转染质粒，由上海生博生物医药科技有限公司设计并合成，并进行慢病毒滴度测定（病毒滴度为1×109TU/ml）。

1.2.2  分组与建模  选取10只大鼠作为对照组，另外40只按照沈凌筠等[7]研究中肺结核大鼠的建立方法构建模型，采用0.9%氯化钠溶液制作结核分枝杆菌悬液，于斜面培养基进行接种，37℃下培养5周，制作浓度、质量为5mg/ml的菌悬液，将0.2ml菌悬液注射于大鼠尾静脉，建立肺结核模型，对大鼠肺组织病理切片检查，出现干酪样坏死、液化灶即为建模成功。共有10只大鼠建模失败。将建模成功的30只大鼠分为模型组（n=10）、沉默组（n=10）、过表达组（n=10），对照组大鼠给予尾静脉注射0.2ml生理盐水。

1.2.3  miRNA-27a转染  沉默组大鼠尾静脉注射10μl miRNA-27a沉默慢病毒悬液，过表达组大鼠尾静脉注射10μl miRNA-27a过表达慢病毒悬液，10?g/d，1次/d，对照组、模型组大鼠注射同剂量生理盐水，1次/d，连续注射5d。

1.3  观察指标

1.3.1  一般情况及病理组织学观察  于miRNA-27a转染后至处死前，对各组大鼠活动、形态、纳食、毛发光泽度等一般情况进行观察。处死后取大鼠肺组织，固定于4%甲醛中，48h后取出，采用梯度乙醇进行处理，并进行石蜡包埋，制作4?m病理切片，采用光学显微镜观察其肺组织变化。

1.3.2  miRNA-27a、JAK2、STAT3表达量检测  取大鼠肺组织，放入液氮中研磨，使用Takara反转录试剂盒反转录为cDNA，采用实时荧光定量法进行鉴定miRNA-27a、JAK2、STAT3表达量，采用Primer5.0软件设计引物序列，反应体系：0.4μl上下游引物、1μlcDNA模板、20μl蒸馏水。反应条件：95℃ 5min、95℃ 15s、58℃ 30s，70℃ 34 s，共进行40个循环，采用2–DDCt方法计算出miRNA-27a、JAK2、STAT3的表达量。miRNA-27a上游、下游引物序列分别为5-TTCACAGTGGCTAAGTTCCGC-3、5-GCGGAA CTTAGCCACTGTGA-3，JAK2上游、下游引物序列分别为5-GAGAATGGCGACTACAATC-3、5-GAA CAGCACCTGCTAAACTG-3，STAT3上游、下游引物序列分别为5-ACCAGCAGTATAGCCGTTC-3、5-GCCACAATCCGGGCAATCT-3，内参GAPDH上游、下游引物序列分别为5-CCTGGCACCCAGC ACAAT-3、5-GGGCCGGACTCGTCATAC-3。

1.3.3  结核分枝杆菌菌落数检测  取大鼠肺组织，进行组织匀浆处理后，采用0.9%氯化钠溶液制作菌悬液，后经硫酸消化，于斜面培养基进行接种，37℃下培养5周，后采用全自动菌落计数仪对菌落进行计数。

1.3.4  炎症因子水平检测  取各组大鼠冷冻血清，解冻后采用酶联免疫吸附法检测γ干扰素（interferon-γ，IFN-γ）、白细胞介素6（interleukin-6，IL-6）、环氧化酶-2（cyclooxygenase-2， COX-2）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）水平，采用碳酸盐缓冲液稀释待测液，倒入孔中，4℃下过夜，后弃去，冲洗干净，孔中加入1%牛血清白蛋白，37℃孵育60min，后弃去，冲洗干净，稀释抗血清，每孔加入0.1ml，37℃下进行轻微摇晃40min，后弃去，冲洗干净，使用TMB进行显色处理，后在450nm波长下检测吸光度，查出IFN-γ、IL-6、COX-2、TNF-α表达水平。

1.3.5  JAK2/STAT3通路蛋白表达量  采用蛋白免疫印迹法检测大鼠肺组织中的JAK2、STAT3、p-JAK2、p-STAT3蛋白相对表达量，取各组大鼠冷冻肺组织，冰上溶解25min，制作组织匀浆，进行离心处理，使用BCA试剂盒检测蛋白含量，提取等量蛋白质，采用凝胶电泳进行分离蛋白质，加入一抗，4℃下孵育过夜，漂洗，每次15min，3次，加二抗，孵育2h，漂洗，每次15min，3次，以GAPDH为内参，定量分析蛋白表达情况。

1.4  统计学方法

采用SPSS 19.0统计学软件对数据进行处理分析。计量资料以均数±标准差（）表示，组间比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2  结果

2.1  一般情况观察

对照组大鼠皮毛顺滑、反应灵敏、饮食正常、活动较多；模型组大鼠皮毛干枯毛躁、存在脱毛现象、反应较为迟钝、食欲缺乏、活动较少；沉默组大鼠毛发枯黄杂乱、脱毛严重、反应迟钝、食欲缺乏；过表达组大鼠体毛光泽度增加、脱毛现象降低、食欲上升，活动增加。

2.2  病理学特征比较

对照组大鼠肺泡清晰可见，结构正常；模型组大鼠，肺泡形态发生变化，炎症细胞出现浸润状态；沉默组大鼠肺组织结构受到严重破坏，肺泡变形，炎症细胞浸润明显；过表达组大鼠肺组织趋于正常，炎症细胞浸润改善，见图1。

2.3  miRNA-27a相对表达量和结核分枝杆菌菌落数比较

与对照组相比，模型组miRNA-27a表达量降低，结核分枝杆菌菌落数升高，差异均有统计学意义（P<0.05）；与沉默组相比，过表达组miRNA-27a表达量升高，结核分枝杆菌菌落数降低，差异均有统计学意义（P<0.05），见表1、2。

2.4  炎症因子水平及JAK2、STAT3 mRNA表达量比较

与对照组相比，模型组IFN-γ、IL-6、COX-2、TNF-α表达水平及JAK2、STAT3 mRNA表达量均升高，差异均有统计学意义（P<0.05）；与沉默组相比，过表达组IFN-γ、IL-6、COX-2、TNF-α表达水平及JAK2、STAT3 mRNA表达量均降低，差异均有统计学意义（P<0.05），见表3、4。

2.5  JAK2/STAT3信号通路蛋白相对表达量比较

与对照组相比，模型组JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3表达量升高，差异均有统计学意义（P<0.05）；与沉默组相比，过表达组JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3表达量降低，差异均有统计学意义（P<0.05），见表5、6，图1。

3  讨论

肺结核为免疫性疾病，主要是由结核杆菌诱导而产生，可导致自噬异常、炎症、免疫紊乱等，具有较高的传染性[8-9]。临床治疗肺结核的药物通常使用较长疗程，且肝肾毒性较强，可使患者治疗依从性受到影响，故寻找合适的方法较为重要[10-11]。研究显示，miRNA-27a可控制细胞内结核杆菌的生存[12]。肺部巨噬细胞受到感染后，可使其凋亡加快，促进炎症、氧化应激反应的发展，使患者肺部病理损伤加重[13-14]。本研究结果显示，过表达组肺结核内miRNA-27a表达升高，可使大鼠体内结核分枝杆菌菌落数降低，炎症损伤减轻。相关研究表明，结核杆菌在肺组织内扩散，可加重体内炎症、氧化反应，在大鼠肺组织中，增生型结核结节较多，且肺组织具有明显炎症细胞浸润，过表达miRNA-27a可使肾缺血再灌注、脊髓损伤中的炎症反应减轻，减轻肺组织炎症损伤[15-16]。本研究与其结果相符，表明过表达miRNA-27a，可降低结核分枝杆菌菌落数、减轻炎症反应。

本研究结果显示，上调miRNA-27a表达，JAK2、STAT3、p-JAK2、p-STAT3表达量降低，且炎癥因子水平得到改善，表明过表达miRNA-27a改善大鼠体内炎症因子水平可能通过抑制JAK2/STAT3通路，促进抗结核的免疫反应，使肺结核的发展受到抑制。有研究显示，上调miRNA-27a表达，可减轻机体内炎症反应，降低IFN-γ、IL-6、COX-2、TNF-α表达，使肺组织损伤减轻。肺结核的发生可使体内发生过度炎症反应、过氧化损伤，故对其炎症反应进行控制，抑制体内氧化应激状态为治疗肺结核的有效措施[17]。JAK2/STAT3可介导炎症反应的发生，对JAK2/STAT3通路进行抑制，可使p-JAK2、p-STAT3水平降低，减轻体内炎症反应，使肺细胞凋亡降低，改善肺组织损伤[18-19]。以上研究与本研究结果一致，表明过表达miRNA-27a可抑制JAK2/STAT3信号通路，抑制肺结核的发展。

综上所述，肺结核发生后结核杆菌菌落数升高，机体内炎症因子水平上升，经过表达miRNA-27a干预后可改善上述情况，其机制可能与JAK2/STAT3信号通路被抑制有关。

[参考文献][1] BOOM W H， SCHAIBLE U E， ACHKAR J M. The knowns and unknowns of latent mycobacterium tuberculosis infection[J]. J Clin Invest， 2021， 131（3）： 13–22.

[13] 張爱平， 杨江华， 梁曼曼， 等. 231例结核分枝杆菌培养阳性肺结核患者的耐药情况分析[J]. 皖南医学院学报， 2021， 40（3）： 229–232.