c-Myc抑制剂10058-F4对实验性自身免疫性葡萄膜炎小鼠模型Th17细胞比例及细胞因子表达的影响△

刘玉玲 赵 璐 杨 超 陈思思 魏瑞华 粘 红

自身免疫性葡萄膜炎是常见的致盲性眼病,易反复发作,可造成严重的视力损害[1-2]。由光感受器间维生素A类结合蛋白(IRBP)诱导的实验性自身免疫性葡萄膜炎(EAU)小鼠模型是自身免疫性葡萄膜炎经典的动物模型,能够较好地模拟人类自身免疫性葡萄膜炎的发病特征[3-5]。研究发现,辅助性T细胞17(Th17细胞)是自身免疫性葡萄膜炎中重要的致病性T细胞亚群[6],以分泌白细胞介素(IL)-17为特征[7]。c-Myc是Th17细胞分化过程中关键的转录因子[8-9]。c-Myc通过与伴侣蛋白Max形成异二聚体,进一步与DNA元件结合并激活转录,从而参与T细胞活化等多种生物学进程[10-11]。在初始CD4+T细胞向Th17细胞分化过程中c-Myc表达会增加[12],体外抑制其表达可减少Th17细胞比例[13]。但c-Myc对EAU小鼠模型IRBP1-20特异性Th17细胞的调控作用尚未见报道。10058-F4是c-Myc的特异性小分子抑制剂,具有稳定性好、细胞渗透能力强和靶向选择性高等优点,广泛用于抑制c-Myc活性[14]。本研究探讨c-Myc抑制剂10058-F4对EAU小鼠模型IRBP1-20特异性Th17细胞比例及细胞因子表达的影响。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器10058-F4(美国Selleck公司),百日咳毒素、弗氏不完全佐剂、佛波醇12-十四酸酯-13-乙酸酯、布雷菲尔得菌素A、钙离子霉素(美国Sigma公司),结核分枝杆菌H37RA(美国Difco公司),IRBP1-20多肽片段(上海生物工程股份有限公司合成),RPMI1640培养基、胎牛血清(美国HyClone公司),RNA提取试剂盒(美国EZBioscience公司),逆转录试剂盒(美国Thermo公司),小鼠IL-17 ELISA试剂盒、重组小鼠IL-4、重组小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、重组小鼠IL-23(美国R&D公司),巯基化藻红蛋白(PE)标记的抗小鼠CD4流式抗体(PE-CD4)、固定剂、破膜剂、TruStain FcXTMPLUS封闭剂、异硫氰酸荧光素(FITC)标记的抗小鼠IL-17流式抗体(FITC-IL-17)(美国Biolegend公司);LightCycler 480实时荧光定量PCR(qRT-PCR)仪(瑞士Roche公司),FACSCalibur流式细胞仪(美国BD公司),Micron IV小动物视网膜成像系统(美国Phoenix公司)。

1.2 实验动物分组、EAU模型建立及T细胞制备取健康C57BL/6J小鼠(8～10周龄)6只,体重约20 g,购自北京维通利华实验动物技术有限公司。动物饲养环境及实验操作均符合《实验动物管理条例》的规定,并获得天津医科大学动物管理及使用委员会的批准(批文号:TJYY2019110117)。

采用随机数字表法将小鼠分为正常对照组、EAU组,每组3只。EAU组小鼠腹腔内注射350 ng百日咳毒素,单后足和脊柱两侧皮下注射含150 μg IRBP1-20、0.8 mg结核分枝杆菌H37RA和弗氏不完全佐剂的乳化剂以诱导EAU模型;正常对照组小鼠不给予特殊干预。免疫后13 d,行间接检眼镜检查并通过小动物视网膜成像系统可视化检测小鼠眼底炎性病灶,参照Caspi评分标准对眼底炎症程度进行评分;摘出眼球制作石蜡切片,行HE染色,采用光学显微镜观察小鼠组织病理学改变,依据Caspi评分标准进行评分[15],鉴定EAU模型是否建立成功。同时,取小鼠脾脏,引流淋巴结,研磨后用尼龙柱过滤,分离得到T细胞悬液。

1.3 骨髓来源树突细胞的制备采用颈椎脱臼法处死小鼠,分离小鼠双侧股骨和胫骨,用1 mL无菌注射器吸取培养基反复冲洗骨髓腔得到骨髓细胞悬液,用棉花柱过滤以除去肌肉组织和骨碎片。在4 ℃条件下,1264 r·min-1离心细胞悬液8 min,弃去上清液。将细胞重悬后接种于培养板中并加入10 μg·L-1IL-4和GM-CSF以诱导骨髓细胞向树突细胞分化,培养3 d后半量换液并补充细胞因子,6 d后加入100 μg·L-1脂多糖刺激24 h得到成熟的骨髓来源树突细胞。

1.4 T细胞的药物预处理及其与骨髓来源树突细胞的共培养将EAU模型小鼠T细胞分为对照组和10058-F4组,10058-F4组T细胞加入50 μmol·L-110058-F4,对照组T细胞不给予药物干预。培养6 h后,洗去药物,将两组T细胞与IRBP1-20(10 mg·L-1)及成熟的骨髓来源树突细胞共培养,同时加入20 μg·L-1IL-23(Th17细胞诱导条件)。

1.5 qRT-PCR检测c-Myc、维甲酸相关核孤儿受体γt、IL-17A、IL-17F和GM-CSF mRNA相对表达量提取各组细胞及眼球组织总RNA,逆转录合成cDNA,以cDNA为模板实施qRT-PCR,反应条件为95 ℃预变性10 min,95 ℃变性15 s,60 ℃退火及延伸1 min,40个循环。以β-actin为内参,采用2-ΔΔCt法分析T细胞中c-Myc、维甲酸相关核孤儿受体γt(RORγt)、IL-17A、IL-17F、GM-CSF mRNA相对表达量。β-actin正向引物序列为5’-CACTGTCGAGTCGCGTCCA-3’,反向为5’-ATGCCGGAGCCGTTGTC-3’;c-Myc正向引物序列为5’-ACCGCCTACATCCTGTCCAT-3’,反向为5’-CTCGTCGTTTCCTCAATAAGTCC-3’;RORγt正向引物序列为5’-CCTCAGCGCCCTGTGTTTT-3’,反向为5’-GAGAACCAGGGCCGTGTAGA-3’; IL-17A正向引物序列为5’-CCTGGCGGCTACAGTGAAG-3’,反向为5’-TTTGGACACGCTGAGCTTTG-3’; IL-17F正向引物序列为5’-CACCTGTGTCAAGCCCATTG-3’,反向为5’-TGATTTTTGTATGCAGCGTTGTC-3’; GM-CSF正向引物序列为5’-CACCCGCTCACCCATCAC-3’,反向为5’-TTCTTTGATGGCCTCTACATGCT-3’。

1.6 ELISA检测共培养细胞上清液中IL-17含量收集各组共培养48 h后细胞上清液,按照ELISA试剂盒说明书操作,检测450 nm处吸光度值,根据标准曲线,计算IL-17含量。

1.7 流式细胞仪检测共培养细胞中Th17细胞比例收集各组共培养8 d后细胞并将其加入含50 μg·L-1佛波醇12-十四酸酯-13-乙酸酯、1 mg·L-1布雷菲尔得菌素A和1 mg·L-1钙离子霉素的培养基中刺激4 h,用TruStainFcXTMPLUS封闭细胞表面Fc受体后,加入PE-CD4抗体于4 ℃避光孵育1 h染色,破膜固定过夜;加入FITC-IL-17抗体于4 ℃避光孵育2 h染色。洗涤并重悬细胞后,用流式细胞仪检测共培养细胞中Th17细胞比例。

1.8 统计学方法采用GraphPad Prism 8.0.1软件进行统计学分析。计量资料以均数±标准差表示。采用Shapiro-Wilk检验数据符合正态分布。组间差异比较采用独立样本t检验。检验水准:α=0.05。

2 结果

2.1 EAU模型的建立小动物视网膜成像系统检查结果显示,免疫后13 d, EAU组小鼠眼底出现轻度的血管炎及弥漫性点状浸润,视盘边缘模糊。眼球组织病理学检查可见,EAU组小鼠视网膜和玻璃体内出现少量炎症细胞浸润和局部视网膜皱褶(图1)。正常对照组小鼠相关改变不明显,说明EAU组小鼠模型建立成功。

图1 免疫后13 d各组小鼠眼底及组织病理学改变 白色箭头示血管炎,绿色箭头示视盘水肿,蓝色箭头示点状炎性浸润灶,黑色箭头示视网膜皱褶,红色箭头示视网膜及玻璃体内炎症细胞浸润。

2.2 EAU组小鼠T细胞和眼球组织中c-Myc mRNA的表达水平qRT-PCR检测结果显示,EAU组小鼠T细胞、眼球组织中c-Myc mRNA相对表达量分别为1.85±0.37、2.31±0.47,较正常对照组(1.01±0.02、0.99±0.05)均明显升高,差异均有统计学意义(P=0.017、0.008)。

2.3 对照组和10058-F4组T细胞c-Myc mRNA相对表达量qRT-PCR检测结果显示,10058-F4组T细胞c-Myc mRNA相对表达量为0.57±0.03,明显低于对照组(1.04±0.02),差异有统计学意义(P<0.001)。

2.4 对照组和10058-F4组共培养细胞上清液中IL-17含量ELISA检测结果显示,10058-F4组共培养细胞上清液中IL-17含量明显低于对照组,差异有统计学意义(P=0.025)(图2)。

图2 对照组和10058-F4组共培养细胞上清液中IL-17含量 与对照组相比,*P<0.05。

2.5 对照组和10058-F4组共培养细胞中Th17细胞比例流式细胞仪检测结果显示,10058-F4组共培养细胞中Th17细胞比例为(17.97±0.91)%,明显低于对照组[(22.50±0.90)%],差异有统计学意义(P=0.004)(图3)。

图3 对照组和10058-F4组共培养细胞中Th17细胞比例

2.6 对照组和10058-F4组T细胞RORγt、IL-17A、IL-17F、GM-CSF mRNA相对表达量qRT-PCR检测结果显示,10058-F4组T细胞RORγt、IL-17A、IL-17F、GM-CSF mRNA相对表达量分别为0.52±0.11、0.51±0.06、0.58±0.15、0.75±0.03,明显低于对照组(1.01±0.01、1.00±0.01、1.02±0.02、1.01±0.02),差异均有统计学意义(均为P<0.05)。

3 讨论

Th17细胞是一类特异表达转录因子RORγt和细胞因子IL-17的CD4+T细胞亚群[16]。研究发现Th17细胞在活动性葡萄膜炎患者外周血单个核细胞中比例上调[17],抑制其分化可显著减轻葡萄膜炎患者活动期的炎症反应[18]。因此,探讨Th17细胞的调控机制对葡萄膜炎治疗至关重要。目前研究发现,转录因子c-Myc在Th17细胞分化中起重要作用[8-9,19],但其对EAU动物模型Th17细胞的调控作用尚未见报道。10058-F4是一种新型c-Myc小分子抑制剂,特异性靶向干扰c-Myc和Max异二聚化并显著降低c-Myc mRNA及蛋白的表达[20-22]。本研究采用10058-F4干扰T细胞中c-Myc表达,研究c-Myc对EAU小鼠模型IRBP1-20特异性Th17细胞的调控作用。

c-Myc是参与Th17细胞分化和功能作用的关键转录因子[8]。研究表明,在初始CD4+T细胞向Th17细胞分化过程中c-Myc表达增加,损伤IL-2诱导型T细胞激酶信号转导通路可降低下游因子c-Myc表达并抑制Th17细胞分化[12]。研究证实,c-Myc在寻常型天疱疮、重症肌无力等多种自身免疫性疾病患者中高表达[23],表明c-Myc的异常表达与自身免疫性疾病的发生密切相关。本研究发现,与正常对照组相比,EAU组小鼠T细胞和眼球组织中c-Myc mRNA表达显著升高,提示c-Myc可能参与自身免疫性葡萄膜炎的发生发展。此外,Webb等[24]研究发现,c-Myc抑制剂10058-F4能够下调精氨酸甲基转移酶5诱导的实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠抗原特异性T细胞扩增。本研究结果表明,10058-F4可显著降低IRBP1-20特异性T细胞中c-Myc mRNA表达水平,提示抑制c-Myc活性能影响IRBP1-20特异性Th17细胞的功能。

RORγt作为Th17细胞分化的特异性转录因子,在Th17细胞分化及其介导的自身免疫性疾病中发挥重要作用。研究证实,RORγt抑制剂可阻碍Th17细胞分化并减轻EAU炎症反应[25]。本研究发现,10058-F4可显著降低IRBP1-20特异性T细胞RORγt mRNA表达水平;同时,10058-F4组共培养细胞中Th17细胞比例显著低于对照组,提示c-Myc的抑制作用可能通过下调RORγt表达来抑制Th17细胞生成。IL-17A和IL-17F是IL-17细胞因子家族的重要成员[26],其作为Th17细胞的标志性细胞因子及效应的主要执行者[27],可诱导多种细胞产生促炎症细胞因子及趋化因子,放大局部炎症反应进而引起组织病理损伤[5,28]。Zhang等[29]研究发现,在炎症性肠病模型小鼠中,普拉梭菌引起的c-Myc泛素化降解可导致Th17细胞分泌IL-17减少,从而减轻Th17细胞介导的结肠炎症。本研究结果显示,10058-F4能够降低Th17细胞标志性细胞因子IL-17A和IL-17F mRNA表达,同时ELISA检测结果显示,10058-F4组共培养细胞上清液中IL-17含量显著低于对照组,提示抑制c-Myc表达可负向调控IRBP1-20特异性Th17相关细胞因子分泌。GM-CSF是致病性Th17细胞的效应细胞因子,对于维持Th17细胞的致病性和稳定性至关重要[30-31]。本研究中,10058-F4抑制c-Myc表达可导致GM-CSF mRNA表达水平显著降低,表明c-Myc在致病性Th17炎症反应引起的细胞因子分泌中起关键作用,抑制其活性可能缓解EAU病变进程。

综上所述,c-Myc抑制剂10058-F4可显著降低IRBP1-20特异性T细胞中c-Myc表达水平,抑制Th17细胞特异性转录因子RORγt表达及效应细胞因子IL-17A、IL-17F、GM-CSF的产生,负向调控IRBP1-20特异性Th17细胞免疫反应。由此提示,靶向抑制c-Myc 表达可能对EAU具有治疗作用。