基于色度、有效成分相关性的蒲黄炒炭识别模式

刘敏洁,黄 琪,2,吴德玲,2,赵宏苏,金传山,2,许凤清,2

(1.安徽中医药大学 中药饮片制造新技术安徽省重点实验室,安徽 合肥 230012;2.国家中医药管理局中药炮制技术传承基地, 安徽 合肥 230038)

蒲黄(PollenTyphae)为香蒲科植物水烛香蒲TyphaangustifoliaL.、东方香蒲TyphaorientalisPresl或同属植物的干燥花粉,具有止血、化瘀、通淋之功效[1]。蒲黄中主要化学成分有黄酮类、甾醇类、烷烃类、有机酸类等,具有止血、抗血栓形成、调节免疫等药理作用[2-4]。蒲黄炭(PollenTyphaeCarbonisata)是中医临床常用品种,由蒲黄按炒炭法炒制成棕褐色或黑褐色。蒲黄因质地疏松,炒炭过程中受温度、投料量、翻炒频率及炒制时间等因素的影响,难以把握其准确的炮制程度,容易造成饮片炮制“不及”或“太过”,影响药材质量及临床疗效。随着色差仪在中药领域质量控制中的应用[5-8],Ren等[9]用其成功区分干燥箱制备的3种不同程度的蒲黄炭。目前,关于传统炮制工艺炮制的蒲黄炭及其整个炒炭过程中饮片颜色和成分含量变化的关联性未见报道。本研究采用传统炮制工艺制备蒲黄炭,测定不同炮制程度蒲黄炭有效成分含量及色度值,结合化学计量学分析方法,对蒲黄炭炮制过程中外观颜色与内在质量进行相关性分析,为蒲黄炭的炮制识别模式提供科学依据。

1 材料

1.1 仪器与试剂 SHIMADZU-LC-2030C高效液相色谱仪(自动进样器SIL-20AC,二极管阵列检测器SPD-20AV,柱温箱CTO-20AC,色谱工作站):日本岛津公司;Agilent Eclipse XDB-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm):美国安捷伦科技有限公司;KQ-400KDE型高功率数控超声清洗器:江苏省昆山市超声仪器有限公司;十万分之一电子天平(AB135-S):瑞士梅特勒-托利多公司;色差仪(IRIS VA400视觉分析仪):法国ALPHA M.O.S公司。

香蒲新苷对照品(批号 MUST-20081902,纯度 99.42%)、异鼠李素-3-O-新橙皮苷对照品(批号 MUST-20082104,纯度 99.45%):四川省成都曼思特生物科技有限公司;甲醇、乙腈(色谱纯):上海跃胜贸易有限公司;冰醋酸(分析纯):上海阿拉丁生化科技有限公司;超纯水:浙江娃哈哈宏振饮用水有限公司。

1.2 药材 9批蒲黄药材来源信息见表1,经安徽中医药大学杨青山副教授鉴定为香蒲科植物水烛香蒲TyphaangustifoliaL.的干燥花粉。

表1 蒲黄基本信息表

2 方法

2.1 蒲黄药材指纹图谱的建立

2.1.1 供试品溶液的制备 精密称取生蒲黄0.5 g,置于具塞锥形瓶中,精密加入70%甲醇25 mL,称定质量,超声(功率250 W,频率40 kHz)提取30 min,放冷,再称质量,以提取溶剂补足所减失的质量,过滤,滤液过0.22 μm微孔滤膜,取续滤液,即得。

2.1.2 混合对照品溶液的制备 取香蒲新苷对照品、异鼠李素-3-O-新橙皮苷对照品适量,精密称定,置10 mL容量瓶中加入70%甲醇,溶解,定容至刻度线,制成每毫升含有香蒲新苷0.259 mg、异鼠李素-3-O-新橙皮苷0.263 mg的混合对照品溶液。

2.1.3 色谱条件 色谱柱:Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm);检测波长:254 nm;柱温:30 ℃;进样量:20 μL;流速:1.0 mL/min;以0.2%冰醋酸水溶液(A)-乙腈(B)为流动相进行梯度洗脱(0～5 min,5%～10% B;5～15 min,10%～14% B;15～35 min,14% B;35～40 min,14%～20% B;40～55 min,20%～24% B;55～60 min,24%～35% B;60～65 min,35%～40% B;65～67 min,40%～5% B)。

2.1.4 蒲黄药材指纹图谱的建立 取9批蒲黄药材,按照“2.1.1”中方法制备成供试品溶液,按照“2.1.3”中色谱条件进行测定。将所测得的色谱图导入“中药指纹图谱相似度评价系统2012版”,对蒲黄药材进行色谱峰匹配,以中位数矢量法生成对照图谱(R),并计算与对照图谱R的相似度。

2.2 蒲黄中有效成分含量测定

2.2.1 标准曲线绘制及系统适应性试验 取混合对照品溶液依次稀释,制成含香蒲新苷259 μg/mL→4.05 μg/mL,异鼠李素-3-O-新橙皮苷263 μg/mL→4.11 μg/mL等7个不同浓度的混合对照品溶液。精密吸取20 μL,依法测定峰面积。以进样质量(μg)为横坐标(x)、峰面积为纵坐标(y)绘制标准工作曲线。依据2020年版《中华人民共和国药典》,进行精密度(对照品混合溶液)、稳定性(S4)、重复性(S4)和准确度(S4)试验。

2.2.2 含量测定 取9批不同批次的蒲黄药材适量,依照上述“2.1.1”中方法制备成供试品溶液,按照上述“2.1.3”色谱条件进行测定。

2.3 颜色测定

2.3.1 不同程度蒲黄炭饮片样品的制备 取蒲黄药材9批(编号S1—S9),按照2020年版《中华人民共和国药典》(通则0213)中炒炭法[1]制备蒲黄炭,炮制过程中,通过测温枪测得锅中温度为160～200 ℃时,取蒲黄药材至热锅内,每隔65 s 取样1次,分别制成不同程度蒲黄炭。在此炮制过程中,取样编号记作TP(代表生蒲黄)和TPC1—TPC6(分别代表6种炮制程度的蒲黄炭),备用。见图1。

图1 生蒲黄(TP)和不同炮制程度蒲黄炭(TPC1—TPC6)饮片

2.3.2 色彩分析仪参数设置 开启IRIS VA400型视觉分析仪,开始预热,待指示灯显示绿灯时,表示预热结束且系统稳定,再对仪器镜头的曝光度和焦距进行校准,并使用标准比色板对仪器进行校准。校准完成后将照明模式设置为顶部照明,拍照模式为单一快照。

2.3.3 样品颜色测定 取蒲黄样品粉末(过四号筛)适量,于载玻片上压制成厚度为1 mm左右的薄片,将载玻片置于仪器白色底板上,变换位置,平行拍照3次,根据色彩编码记录样品色度空间参数L、a、b值,并依据公式Eab=(L2+a2+b2)1/2计算样品的平均总色度值Eab值。其中L值反映亮度(黑白),a代表红绿色相(正数表示偏红,负数表示偏绿),b值代表黄蓝色相(正数表示偏黄,负数表示偏蓝)。

2.3.4 建立颜色判别函数 将样本数据分为生品、轻炭、标炭、重炭4组,采用SPSS 23.0软件进行Kruskal-wallisH检验,对不同组间颜色差异性进行分析,利用判别分析方法建立基于色度空间参数的数学函数。

2.4 不同炮制程度蒲黄炭含量测定及相关性分析

2.4.1 不同炮制程度蒲黄炭两种成分含量测定 取生蒲黄及不同炮制程度蒲黄炭样品,按照“2.1.1”项制备供试品溶液,按上述“2.1.3”项下色谱条件,记录色谱峰面积,计算香蒲新苷和异鼠李素-3-O-新橙皮苷含量。

2.4.2 颜色与有效成分含量相关性分析 将蒲黄中有效成分香蒲新苷和异鼠李素-3-O-新橙皮苷的含量与色度值L、a、b、Eab相关联,使用SPSS 23.0软件作相关性分析。

3 结果

3.1 蒲黄药材指纹图谱分析 测得9批蒲黄药材指纹图谱(见图2),相似度结果见表1。对照品指纹图谱见图3。通过比较各色谱峰的保留时间,确定指纹图谱中香蒲新苷(10号峰)和异鼠李素-3-O新橙皮苷(12号峰)的位置。其中10号峰色谱响应值较高,保留时间适中,故选择10号峰为参照峰。按照相关方法进行方法学考察。结果显示,精密度试验中,17个共有峰相对保留时间的RSD为0.01%～0.15%,各共有峰相对峰面积的RSD为0.02%～2.54%;稳定性试验中,共有峰相对保留时间的RSD为0.01%～0.26%,各共有峰相对峰面积的RSD为0.06%～2.99%;重复性试验中,测得各共有峰相对保留时间的RSD为0.02%～0.17%,各共有峰相对峰面积的RSD为0.03%～1.14%。结果表明,所建立的指纹图谱可用于蒲黄的定性分析。

图2 9批蒲黄药材(S1—S9)的高效液相色谱指纹图谱和对照图谱(R)

注:1.香蒲新苷;2.异鼠李素-3-O-新橙皮苷图3 对照品的高效液相色谱指纹图谱

3.2 含量测定 方法学考察结果显示,香蒲新苷的标准曲线方程为y=1 428 923.5x-69 316.3,线性范围为0.081～5.180 μg(r=0.999 3);异鼠李素-3-O-新橙皮苷回归方程为y=1 825 126.9x-102 083.4,线性范围为0.082～5.260 μg(r=0.999 2)。精密度试验中,香蒲新苷、异鼠李素-3-O-新橙皮苷峰面积的RSD分别为0.19%、0.20%(n=6);在稳定性试验中,香蒲新苷、异鼠李素-3-O-新橙皮苷峰面积的RSD分别为0.23%、0.27%(n=6);在重复性试验中,香蒲新苷、异鼠李素-3-O-新橙皮苷含量的RSD值分别为2.09%、2.27%,平均回收率分别为101.50%、98.02%,RSD分别为2.07%、1.62%(n=9)。结果表明,该方法准确、可行。9批蒲黄药材含量测定结果见表2。不同炮制程度蒲黄炭中香蒲新苷和异鼠李素-3-O-新橙皮苷含量测定结果(见表3)显示,随着炮制时间的延长,炭品中香蒲新苷和异鼠李素-3-O-新橙皮苷的含量呈现降低趋势,综合外观、性状将样品TPC4和TPC5标注为标炭,TPC1、TPC2、TPC3为轻炭,TPC6因炮制时间过长,样品完全炭化,此时香蒲新苷和异鼠李素-3-O-新橙皮苷的色谱峰未检测到,标注为重炭。

表2 9批蒲黄药材中香蒲新苷和异鼠李素-3-O-新橙皮苷含量测定结果(n=3)

表3 9批次不同炮制程度蒲黄炭中香蒲新苷和异鼠李素-3-O-新橙皮苷含量测定结果

3.3 不同炮制程度蒲黄炭颜色值与成分之间的相关性

3.3.1 不同炮制程度蒲黄炭色度值比较及其判别函数的建立 9批次不同炮制程度蒲黄炭的L、a、b、Eab值比较,差异有统计学意义(χ2值分别为50.331、15.342、45.087、53.929,均P<0.05),提示不同炮制程度蒲黄炭的颜色有显著差异。见表4。

表4 不同炮制程度蒲黄炭色度值比较

将数据分为生品、轻炭、标炭、重炭4类,以类别为组变量,色度值L、a、b、Eab为自变量,并且作为训练集样本,采用SPSS 23.0软件建立以L、a、b、Eab值为输入变量的判别函数。再将训练样本回代[10-11],验证判别函数的准确性良好。

根据组平均值的同等检验结果可见,L、a、b、Eab值的P值均<0.05,表明在判别函数中,L、a、b、Eab值均具有统计学意义。

Wilk’s Lambda检验结果显示,3个典则判别函数有统计学意义(λ值分别为0.060、0.564、0.898,均P<0.05)。

3个标准化典则判别函数:

y1=3.149L+1.059a+0.505b-1.728Eab;

y2=10.327L+1.984a+1.257b-9.492Eab;

y3=2.965L-0.318a+0.149b-2.647Eab。

3个未标准化典则判别函数:

y1=0.384L+0.366a+0.069b-0.212Eab-12.429;

y2=1.260L+0.687a+0.172b-1.167Eab-8.005;

y3=0.362L-0.110a+0.020b-0.326Eab+0.279。

根据典则判别函数建立的典则判别函数图(见图4),提示不同炮制程度的蒲黄炭颜色差异较明显,并且在系数1上呈现一定的规律。

注:1.生品;2.轻炭;3.标炭;4.重炭图4 4种炮制程度蒲黄炭的典则判别函数图

4个Fisher线性判别函数:

F生品=9.840L+12.084a+0.190b-5.801Eab-173.454;

F轻炭=11.015L+12.147a+0.293b-7.202Eab-149.928;

F标炭=9.904L+11.161a+0.098b-6.705Eab-108.731;

F重炭=6.637L+8.757a-0.413b-4.082Eab-68.201。

将未知样本的色度值分别代入4个函数中进行计算,将样本判入所得函数值最大的分组中。

3.4 色度值与有效成分含量相关性分析 香蒲新苷、异鼠李素-3-O-新橙皮苷的含量与L、a、b、Eab值均不符合正态分布,故选择Spearman相关分析对数据进行处理,结果见表5。从表5可看出,L值与香蒲新苷和异鼠李素-3-O-新橙皮苷含量呈正相关(P<0.05),表明在一定程度上,L值越小,亮度越低,蒲黄炒炭程度越高,香蒲新苷含量、异鼠李素-3-O-新橙皮苷含量越低。a值与香蒲新苷和异鼠李素-3-O-新橙皮苷含量均无相关性(P>0.05)。b值与香蒲新苷、异鼠李素-3-O-新橙皮苷含量呈正相关(P<0.05),表明在一定程度上b值越大,香蒲新苷、异鼠李素-3-O-新橙皮苷含量越高。Eab值与香蒲新苷、异鼠李素-3-O-新橙皮苷含量均呈显著正相关(P<0.05),表明Eab值越大,香蒲新苷、异鼠李素-3-O-新橙皮苷含量较高。

表5 香蒲新苷、异鼠李素-3-O-新橙皮苷含量与L、a、b、Eab值的相关性

4 讨论

蒲黄质地疏松,炒制过程中易灰化,其炮制程度难以把握,容易造成“不及”或“太过”,从而影响饮片质量。本研究基于9批蒲黄药材,建立蒲黄药材的高效液相色谱指纹图谱,9批蒲黄药材相似度均大于0.98,表明9批蒲黄药材与对照图谱具有较好的一致性,饮片批次间差异较小。并对指标性成分香蒲新苷和异鼠李素-3-O-新橙皮苷含量进行测定。在此基础上,取9批蒲黄药材,分别炮制不同程度蒲黄炭,并且通过对不同炮制程度蒲黄炭的色度值进行测定和分析,发现不同炮制程度蒲黄炭的色度值L、a、b、Eab差异均有统计学意义,随着炮制时间的延长,蒲黄炭饮片色度值L、b、Eab均逐渐减小。将不同炮制程度蒲黄炭的色泽与内在成分含量进行相关性分析,发现色度值L、b、Eab值均与香蒲新苷和异鼠李素-3-O-新橙皮苷含量呈显著正相关,a值与两种成分含量均无相关性。以上结果表明,色度值可作为判断生蒲黄及蒲黄炭质量标准的方法之一,同时色度值与指标性成分之间具有显著的相关性。

颜色是传统中药炭药炮制程度最主要的判别依据,色差计将颜色数字化、精准化,将这一技术与中药中指标性成分分析技术相结合,建立判别函数并对成分与色度进行相关性分析,最终形成中药炭药炮制适中的识别模式,为中药炭药进行精确客观的质量控制提供技术支撑。