牛源肺炎克雷伯氏菌的生物学特性研究※

●李 彬 彭树德 白和平 吴同垒 史秋梅

（1. 秦皇岛抚宁区农业农村局 河北 秦皇岛 066004；2.唐山市食品药品综合检验检测中心 河北 唐山 063000；3.河北科技师范学院 河北省预防兽医学重点实验室 河北 秦皇岛 066004；4.唐河县和杰农业专业合作社 河南 南阳 473000）

肺炎克雷伯氏菌为革兰氏阴性、需氧、无动力杆菌，是一种条件性致病菌，属于肠杆菌科克雷伯氏菌属。克雷伯氏菌是一种重要的人畜共患条件性致病菌，长期存在于动物肠道及上呼吸道，通常在机体免疫力低下时或环境条件发生改变时引起继发性感染，近年来陆续报道出该菌引起不同动物源性疾病[1]。2021 年11 月河北秦皇岛某奶牛养殖场出现母牛化脓性乳房炎及犊牛呼吸道症状，从临床样品中分离出2 株致病性肺炎克雷伯氏菌，本研究通过荚膜型血清型分型、毒力基因与耐药基因检测以及药物敏感性试验，研究牛源肺炎克雷伯氏菌的生物学特性，以期为该病的防控提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器

LB 培养基，均购自北京陆桥；PCR 试剂均购自天根公司；抗生素药敏纸片（大观霉素、多粘菌素B、环丙沙星、诺氟沙星、恩诺沙星、头孢曲松、卡那霉素、新霉素、氧氟沙星、庆大霉素、阿米卡星、乙酰甲喹、氟苯尼考、磺胺间甲氧、磺胺二甲氧、头孢拉定），均购自杭州微生物试剂有限公司；肺炎克雷伯氏菌基因组DNA，在河北省预防兽医学重点实验室提取、保存。

1.2 引物设计与合成

合成肺炎克雷伯氏菌K1、K2、K5、K20、K54、K57 等6 种主要荚膜血清型鉴定引物；毒力基因黏附素（mrkD、FimH、UreA、allS）、脂多糖（WabG）、荚膜多糖生成调节基因（RmpA、MagA）、铁载体基因（Aerobactin、Uge）特异性鉴定引物，耐药基因碳青霉烯酶（KPC、OXA、NDM）、产头孢菌素β-内酰胺类酶（DHA）、产超广谱β-内酰胺类酶（CTX-M1、TEM）特异性鉴定引物。由上海生工生物科技有限公司合成[2-4]。

1.3 试验方法

1.3.1 荚膜血清型检测采用PCR 法扩增K1、K2、K5、K20、K54、K57 等6 种主要荚膜血清型，PCR 反应体系为：2×Tqmaster Mix 10 μL，上、下游引物各1 μL，模板1 μL，超纯水7 μL。PCR反应条件为95℃预变性5 min；94℃变性30 s，50～55℃退火30 s，72℃延伸90 s，72℃终延伸10 min。取扩增产物5 μL，经1%琼脂糖凝胶电泳检测，条带大小符合目标条带大小即为阳性。

1.3.2 毒力基因与耐药基因检测采用PCR 法检测分离菌的毒力基因与耐药基因，PCR 体系为2×Taq PCR MasterMix 10 μL，ddH2O 7 μL，上、下游引物1 μL（终浓度为10 μmol/L）、模板各1 μL，同时设置阴性对照。PCR 条件为：95℃ 5 min；95℃45 s， 50℃ 45 s，72℃ 1 min，30 个 循 环；72℃10 min。PCR 结 束 后 取 扩 增 产 物5 μL，经1 %琼脂糖凝胶电泳检测，条带符合预期即判断为阳性。

1.3.3 药敏试验药敏试验参照美国临床和实验室标准协会（Clinical and Laboratory Standards Institute， CLSI）所述的 K-B 纸片法进行抗生素药敏试验，取过夜培养的菌液200 μL 均匀涂布于LB 琼脂培养基，干燥3～5 min，将药敏纸片贴在培养基表面，37℃培养箱倒置培养24 h，观察抑菌情况，测量抑菌圈直径，并根据美国临床实验室标准化研究所（CLSI）抗菌药物敏感性实验执行标准（CLSI-M100-S19）判断该分离菌对药物的敏感性。

2 结果与分析

2.1 荚膜血清型检测结果

采用PCR 法检测肺炎克雷伯氏菌的主要血清型，获得血清型特异性基因大小为640 bp（图1），与肺炎克雷伯氏菌血清型K2 特异性基因的大小一致，说明本次分离的2 株肺炎克雷伯氏菌均为K2 型。

2.2 毒力基因与耐药基因检测结果

对分离菌株进行肺炎克雷伯氏菌的9 种毒力基因的PCR 检测结果，见表1。

由表1 可知，两株分离菌均携带黏附素（mrkD、FimH）脂多糖（WabG）毒力基因；另外kp-1 株携带铁载体基因（Aerobactin），kp-2 不携带。

耐药基因检测结果，见表2。

表2 耐药基因检测结果

由表2 可知，分离菌株携带产头孢菌素β-内酰胺类酶（DHA-1）、产超广谱β-内酰胺类酶（TEM、SHV），此外kp-1 株携带碳青霉烯酶（KPC）耐药基因。

2.3 药敏试验

药敏试验结果，见表3。

表3 抗生素药敏试验结果

由表3 可知，2 株分离菌均对大观霉素敏感，对多粘菌素B、环丙沙星、诺氟沙星、恩诺沙星、卡那霉素、新霉素、氧氟沙星、庆大霉素、阿米卡星、乙酰甲喹中敏，对氟苯尼考、磺胺间甲氧、磺胺二甲氧耐受。其中菌株kp-1 对头孢曲松中敏，对头孢拉定耐受；菌株kp-2 对头孢曲松敏感，对头孢拉定中敏。

3 讨论与结论

王哲红[5]在新疆地区集约化牛场进行该菌检测，其中鼻拭子样本检出率为11.52%（57/495），肛拭子检出率为28.46%（150/527）；贾丽等[6]在肺炎克雷伯菌所致奶牛肺炎的病原分析及治疗的研究中，从84 份鼻拭子样品中分离到32 株肺炎克雷伯菌，检出率为38.1%（32/84）；买尔哈巴·吾斯曼[7]对我国部分省市规模化奶牛养殖场收集患乳腺炎奶牛的奶样进行肺炎克雷伯菌的检测，检出率达26.5%（131/495）；Katsande 等[8]的研究显示肺炎克雷伯菌占奶牛乳腺炎细菌病原的15.5 %；Aslan 等[9]研究证实肺炎克雷伯氏菌占呼吸道细菌性疾病的20%。以上结果表明了国内外牛源性肺炎克雷伯氏菌的高分离率及致病率。

近年来，由于抗生素的不合理使用，导致菌株耐药性不断增强，有多重耐药表现，耐药性的增强主要由于两个方面，一方面是耐药基因的垂直传播，传给下一代；另一方面是基因重组到质粒上，通过转导、转化、接合的方式传播其耐药基因。本研究耐药基因检测显示分离菌携带TEM、SHV、DHA-1、KPC耐药基因，表明分离菌可能具有进行种内或种间传播以上几种耐药基因的能力。此外耐药基因检测结果与耐药表型不完全一致，这可能由于养殖场日常使用抗生素较多，药物间相互作用，抑制了相关耐药基因的表达，也可能是耐药基因发生突变导致具有同种耐药基因的菌株，对同种抗生素表现的耐药性不同。目前，疫苗被认为是控制传染性疾病的有效手段，但肺炎克雷伯氏菌具有较多血清型，这可能是目前该病原菌性疫苗尚未上市的原因之一，鉴于此对肺炎克雷伯氏菌的日常防控显得尤为重要。