应用微生物制剂LC对甘蔗糖厂滤泥发酵及堆肥效果研究

沈大春，孙东磊，敖俊华，陈立君，杨欣妍，卢颖林

(广东省科学院南繁种业研究所，广东广州 510316)

0 引言

我国是食糖消费大国，其中食糖80%以上来源于甘蔗原料。广泛的甘蔗种植为保障我国食糖资源自给自足奠定有力原料基础。但糖料蔗在生产加工压榨制糖过程中会产生大量废弃物，如大量蔗渣、滤泥和糖蜜及其发酵酒精残液等[1]，如果直接燃烧则会造成大量的资源浪费，而随地弃置又会导致环境污染，特别是甘蔗糖厂滤泥的处理问题，目前大部分是直接还田做肥料或作鱼塘饲料，滤泥直接还田容易引发水体和地下水污染二次污染问题，作鱼塘饲料消化能力有限，同时也容易引起水体富营养化导致水环境污染[2]。

研究表明，甘蔗糖厂滤泥富含丰富的营养物质，含有大量的有机质和部分可溶性碳水化合物(如蔗糖)，同时含有氮磷钾等大量元素，以及钙镁硫硅等中微量元素，养分全面丰富；滤泥既可以作为有机-无机肥料填充剂也可以作为有机堆肥的主要原料[3]，对生产有机-无机肥料过程的粘结度和水分等有较好的调节作用，同时以滤泥作为有机堆肥的主要原料，添加一定比例的碳源包括：蔗渣、糖蜜发酵废液、中药渣和氨基酸有机废料等，利用滤泥高温发酵菌剂的高效腐解作用可以实现堆肥过程中滤泥的高效降解和有机质转化，有利于滤泥堆肥腐熟度提高和物料安全稳定[4]。

但是在滤泥堆肥过程中，大量的水分和胶结物等导致滤泥成团，溶解氧不足，微生物难以进入分解[5-8]，以及滤泥堆肥过程温度的升高导致很多具有发酵降解功能的菌株失去活性——是限制滤泥高温堆肥腐熟稳定的主要因素。在滤泥高温堆肥中接种芽孢杆菌菌株可以加快堆肥过程物质转化，缩短堆肥腐熟的周期[9-10]。高温堆肥过程中起主要作用的是一类耐高温细菌(如芽孢杆菌类菌株)还有少部分真菌和放线菌等[11-12]，若能将滤泥高温堆肥过程中的优势细菌分离进一步和有机载体复配形成高效菌剂，并将其再用于滤泥高温有机堆肥的生产，可能会具有良好的应用前景和市场价值[13-15]。目前已有的有关滤泥肥料化利用的文献主要集中在利用其作为辅料，同时微生物菌株主要是属于外源添加而不属于原位分离来源[16-18]。

本文通过原位筛选分离菌株GBIF-3制备微生物制剂LC，通过添加微生物制剂LC对比研究滤泥固体发酵及堆肥过程指标变化及过程影响，为微生物制剂LC在甘蔗糖业滤泥肥料化利用方面的推广应用提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

地衣芽孢杆菌菌株GBIF-3(通过采集甘蔗糖厂长期堆放滤泥的环境土壤样本，以滤泥为唯一营养源连续富集一周分离得到该优势菌株，进一步通过划线分离得到单一菌株)，2018年11月16日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼)，菌种保藏号为GDMCC NO.60481。其生物学特性为：在LB平板上，24 h后长出菌落，革兰氏阳性G+，菌落生长快，菌落表面相对光滑，单个菌株呈杆状，大小1～2 μm；生理生化试验结果显示菌株淀粉水解、果胶分解、乙酰甲基甲醇试验、柠檬酸盐、氨硝、产硫化氢、吲哚试验都呈阳性“+”；而甲基红试验、石蕊牛乳试验和苯丙氨酸脱氢酶试验呈阴性“-”。

试验地点：选取在广东省韶关市翁源县茂源糖业有限公司内(110.09°E，21.32°N)。供试滤泥为糖厂副产物，水分含量72.10%，pH 6.15，干物质中有机质590.65 g/kg。

1.2 试验方法

1.2.1 微生物制剂LC的制备

将地衣芽孢杆菌菌株GBIF-3接种到LB培养基上，温度50℃，转速170 r/min，振荡培养1～2天，离心后去掉上清液取沉淀，再用100 mL的0.9%灭菌生理盐水重悬，得到细菌菌液，调节细菌菌液的细菌OD值为0.5；将细菌菌液按重量份85%，和重量份甘蔗渣5%、重量份蔗渣生物炭5%以及重量份甘蔗糖蜜5%混合可得到微生物制剂LC。

LB培养基为：蛋白胨10 g、酵母粉5 g、NaCl 10 g、琼脂20 g、水1000 mL，pH自然。

1.2.2 微生物制剂LC的酶活力测定

按照重量比5%接种至装有100g滤泥固体发酵培养基的250 mL三角瓶中，50℃条件下培养箱固体发酵0～30天过程中每天取样(破坏性取样)，发酵液8000 r/min、4℃离心5 min；过滤除去菌体和固体杂质后得到粗酶液，测定木质纤维素酶活和蛋白酶活。酶活力测定方法：取0.5 mL稀释后的粗酶液至试管中，加1 mL 1%的CMC-Na溶液和0.5 mL的磷酸缓冲液(0.1 mol/mL，pH值6.0)混匀，于50℃水浴反应30 min，取出，加入1.5 mL DNS试剂，沸水浴5 min中止反应，冷却至室温，以100℃煮沸10 min失活的粗酶液作为空白对照组，采用3，5-二硝基水杨酸比色法在540 nm下测定还原糖的量，计算酶活。

酶活力定义：酶活力的定义参照国际标准，即在相应的条件下(50℃)1 min内催化底物水解生成1µmol还原糖的酶量定义为一个酶活力国际单位(IU)，简称U。

滤泥固体发酵培养基为：100 g滤泥(以干重计)和50 mL无机盐培养基；所述的无机盐培养基配制方法为：尿素0.3 g、(NH4)2SO41.4 g、KH2PO40.5 g、CaCl2·2H2O 0.4 g、MgSO4·7H2O 0.3 g、蛋白胨1.0 g、FeSO4·7H2O 5.0 mg、MnSO4·H2O 1.6 mg、ZnSO4·7H2O 1.4 mg、CoCl2·6H2O 2.0 mg，pH自然，去离子水1000 mL，121℃高压灭菌20 min。

1.2.3 微生物制剂LC对滤泥固体发酵降解试验

取若干个250 mL的三角瓶，向250 mL三角瓶中加入100 g干滤泥(烘干粉状)和50 mL无机盐培养基，121℃灭菌后，按重量比接种(涡旋仪混匀后，用特制的5 mL灭菌枪头直接吸取已配制好的LC制剂)5%微生物制剂LC，分别置于30℃和50℃培养箱内，纱布封口，发酵30天，实验设置重复3次。以接种等量无菌水作为空白对照。

固体发酵结束后，去除固体发酵物料表面的菌体，于105℃烘干至恒重称重，测定降解率，降解率=(降解前总质量-降解后总质量)/100 g×100%。

1.2.4 微生物制剂LC对甘蔗糖厂滤泥高温堆肥过程效果试验

微生物制剂LC按重量5%比例添加至1000 kg的滤泥堆肥中，周期45天，1000 kg的滤泥堆肥辅料为10 kg尿素、5 kg氨基酸废料、100 kg蔗渣、5 kg玉米秸秆生物炭和50 kg糖蜜及发酵酒精残液，对照为不添加微生物制剂LC，其他保持一致。在整个堆肥过程中每10天翻堆一次，每天从堆体中部随机取样分析物料水分含量和监测堆体上中下最高温度并取平均值。

1.3 数据分析

采用Microsoft Excel 2007进行数据统计和处理，再进一步用SPSS统计软件进行单因素多重比较处理间的差异显著性分析，显著性水平α=0.05。

2 结果与分析

2.1 微生物制剂LC的酶活力测定分析

由图1、2可知，在常温30℃和高温50℃条件下添加微生物制剂LC固体发酵30天过程中，滤泥固体发酵物料木质纤维素酶活和蛋白酶活表现出较大差异，常温30℃条件下，固体发酵物料木质纤维素酶活最高值为30 U/mL，蛋白酶活最高值为9.5 U/mL；而在高温50℃条件下，固体发酵物料木质纤维素酶活最高值可达50 U/g，蛋白酶活最高值可达22 U/mL，而空白对照(不加LC，50℃)酶活基本为0 U/mL保持不变。

图1 微生物制剂LC的木质纤维素酶活情况

总之，添加微生物制剂LC在高温50℃条件下比在常温30℃条件下，固体发酵的最高木质纤维素总酶活提高66.7%以及最高蛋白酶活提高131.6%。

微生物制剂LC按照重量比5%接种至装有100 g滤泥的固体发酵培养基的三角瓶中，采用同空白对照对比的方法研究了菌剂LC在50℃，170 r/min振荡，固体发酵15～30天的酶活变化情况，如图1和图2所示，在常温30℃滤泥固体发酵条件下，微生物制剂LC产木质纤维素酶和蛋白酶总体效率不高，但在高温50℃条件下，微生物制剂LC可以产生大量木质纤维素酶类，产酶较快且维持时间较长。说明添加微生物制剂LC对滤泥固体发酵具有明显的促进作用，同时在不同发酵时间段不同酶活作用强度有差异，也体现了不同酶之间较好的协同作用。综合可知：微生物制剂LC在高温50℃条件下，以甘蔗糖厂滤泥作为营养底物，其与木质纤维素降解相关的木质纤维素总酶活表现出较高的活性，另外，其与蛋白水解相关的蛋白酶活也表现出较高的活性，总体上证明了微生物制剂LC的作用机理：在高温条件下，微生物制剂LC产生的木质纤维素水解酶活性较高，水解作用较强，故在高温下表现出较好的降解作用。

图2 微生物制剂LC的蛋白酶活情况

2.2 微生物制剂LC对滤泥固体发酵降解效果分析

滤泥固体发酵降解效果如图3和表1所示，结果表明，固体发酵30天，空白对照CK和添加微生物制剂LC在30℃和50℃条件下对滤泥固体发酵降解率分别为0.5%、8.84%和26.25%。说明在高温条件下，微生物制剂LC产生的木质纤维素水解酶和蛋白水解酶加可以显著加快滤泥的分解和成分的转化，加速各降解底物的进一步分解和转化，且在高温条件下，微生物制剂LC对滤泥固体发酵的降解作用明显强于常温条件下的固体发酵作用。

表1 微生物制剂LC对滤泥固体发酵降解率

图3 微生物制剂LC对滤泥固体发酵降解效果

2.3 微生物制剂LC对甘蔗糖厂滤泥高温堆肥过程效果试验

由图4可知，添加微生物制剂LC对滤泥堆肥过程温度的影响显示，在整个堆肥过程中，添加微生物菌剂LC可以加速滤泥堆肥温度升高，特别是在初始阶段可以起到快速起爆作用，加速堆肥温度升高，在第10天的堆体温度可以达到73℃，通过翻堆以后在一周内又可以达到最高温度70℃以上，直至第3次翻堆以后，整个堆肥过程由于营养物质消耗进入缓慢降温过程，进入后熟阶段；同时和不添加微生物制剂LC(CK)相比，添加微生物制剂LC处理基础上对堆肥温度提升平均10℃以上，尤其是在高温阶段，和常规堆肥温度最高到50℃相比，添加微生物制剂LC的堆体温度最高可以增加20℃，整体上堆肥温度数据表明，添加微生物制剂LC可促进滤泥堆肥过程温度的提高。

图4 微生物制剂LC对滤泥堆肥过程温度的影响

由图5可知，添加微生物制剂LC对滤泥堆肥过程水分的影响显示，在整个堆肥过程中，添加微生物菌剂LC可以促进滤泥堆肥水分的损失，特别是在翻堆及补充水分，以后随着温度的升高水分损失明显加快，在前30天的堆体水分损失至堆体含水率45%，进入后熟阶段堆肥含水量降至40%以下；同时和不添加微生物制剂LC(CK)相比，添加微生物制剂LC处理基础上对堆肥水分损失平均促进15%以上，其中含水率=(初始含水率-现在含水率)/初始含水率×100%，尤其是在高温阶段，添加微生物制剂LC的堆体水分损失效率增加，整体上堆体水分变化数据图4、5和堆肥温度变化情况表明，添加微生物制剂LC可促进滤泥堆肥过程温度的提高，同时随着堆体温度升高，堆体水分损失量增加。

图5 微生物制剂LC对滤泥堆肥过程水分的影响

3 结论与展望

本文实验得出的主要结论有：①在常温30℃和高温50℃条件下添加微生物制剂LC固体发酵30天，不加LC的空白对照酶活基本为0 U/mL，添加微生物制剂LC在高温50℃条件下比在常温30℃条件下固体发酵的最高木质纤维素总酶活提高66.7%以及最高蛋白酶活提高131.6%。②固体发酵30天，空白对照和添加微生物制剂LC在30℃和50℃条件下对滤泥固体发酵降解率分别为0.5%、8.84%和26.25%。③微生物制剂LC对甘蔗糖厂滤泥高温堆肥过程效果试验表明添加微生物菌剂LC可以加速滤泥堆肥温度升高，最高可以达到73℃，和不添加微生物制剂LC(CK)相比，堆肥温度提升平均10℃以上，最高可以增加20℃。

甘蔗糖厂滤泥发酵和堆肥效果数据表明，添加微生物制剂LC和不添加微生物制剂LC(CK)相比，添加微生物制剂LC很大程度上促进了滤泥堆肥温度的升高和水分的损失。在高温环境下微生物制剂LC在滤泥发酵过程表现出较高的木质纤维素酶活性和蛋白酶活性，本研究结果和相关文献报道结果相近。温度是反映堆肥中有机物降解和微生物活性的关键指标之一。高温堆肥过程可以杀死沙门氏菌、大肠杆菌和蛔虫卵等病原微生物，是实现堆肥无害化处理的关键因子[19-21]。在本次试验中，未添加微生物制剂LC的滤泥降解率在整个发酵过程中均低于添加微生物制剂LC组，表明添加微生物制剂LC可促进滤泥的降解，这与高温固体发酵过程中富含木质纤维素和蛋白酶类功能酶密切相关[22-24]。有关研究也表明，堆肥发酵过程中微生物分泌的胞外酶是促进堆肥无害化、减量化及资源化必不可少的活性物质，不仅能催化降解堆肥物料中各种有机质，还在腐殖质的合成以及污染物毒性的削减等过程中发挥着极其重要的作用，有效控制酶作用对实现有机废弃物资源化利用具有重要意义[25]。

综上所述，本文结果显示添加微生物制剂LC促进了甘蔗糖厂滤泥的降解和堆肥过程温度的升高，在产业化利用上将对甘蔗糖厂废弃物合理循环利用、促进地方糖厂和种植户增收及社会经济稳定具有显著的积极影响。随着农业劳动力减少、农业化肥结构调整以及施肥方式的改变，蔗区土壤营养不平衡和酸化现象近年来呈显著增加趋势，如何提高蔗区的甘蔗产量和糖分一直是广大科研人员、糖厂管理人员和蔗农关心的问题，若能进一步加大对甘蔗糖厂废弃物的转化利用，形成高附加值产品回到甘蔗种植管理土壤中，则可降低化学品投入的生产成本，促进综合经济效益提高。