云南耿马甘蔗宿根矮化病的发生分布和病原分子检测

马永德，王晓燕，李银煳，李 婕，张荣跃，单红丽，黄应昆

(1耿马县农业农村局，云南耿马 677500；2云南省农业科学院甘蔗研究所，云南开远 661699)

0 引言

耿马地处云南省西南部，县域内冬无严寒、夏无酷暑、雨热同季、日照充足、昼夜温差大，有利于甘蔗生长和蔗糖分积累，是中国糖料蔗核心基地县之一，也是云南省甘蔗产业“一县一业”特色县。2021年耿马甘蔗种植面积2.71万hm2，涉及全县47个村民委员会、1个社区和15个农场生产队，种蔗农户达2.25万户10万余人，蔗糖产业已成为云南耿马边疆民族地区“脱贫攻坚、乡村振兴”支柱产业，其在促进边疆地区经济发展、农民增收和助力乡村振兴中发挥着重要作用。

甘蔗宿根矮化病(Ratoon stunting disease，RSD)是由一种寄生在蔗株维管束中的棒杆菌属细菌(Leifsonia xylisubsp.xyli，Lxx)引起的世界性种传病害[1-7]，造成甘蔗宿根年限缩短、种性退化，严重影响甘蔗产量和品质。据调查，受害蔗田一般减产10%～30%[8-12]，干旱缺水时达60%以上，蔗糖分降低0.5%，宿根年限缩短1～2年，每年可造成上亿元的经济损失，严重阻碍了蔗糖产业的高质量发展[13]。国内外研究结果表明，防治RSD最经济有效的措施是种植温水脱毒健康种苗[9,14-15]，此方法对甘蔗具有显著的增产增糖效果，新植蔗增产5.01～49.83 t/hm2；宿根蔗增产4.41～30.84 t/hm2，蔗糖分提高0.35%～0.86%，宿根年限延长2～3年[16-19]。耿马作为云南省甘蔗产业“一县一业”特色县，也是今后甘蔗生产重点布局和最具潜力的发展区域，由于多年均未对RSD在耿马各主产乡镇的分布、发生危害和品种感病程度等进行系统全面调查，致使推广应用温水脱毒健康种苗、有效防控RSD缺乏可靠依据。为此笔者于2022年对云南耿马不同蔗区的RSD发生危害情况进行了系统调查和病原分子检测，分析明确了云南耿马不同蔗区、不同品种、不同植期RSD的发生状况，为甘蔗温水脱毒健康种苗的生产繁殖和推广应用及有效防控甘蔗宿根矮化病提供了科学依据。

1 材料与方法

1.1 病害调查与样品采集

于2022年12月甘蔗成熟期，对云南耿马县耿马镇、贺派乡和四排山乡等主产蔗区宿根矮化病的发生和分布进行了调查和田间采样。采样选择具有代表性的主栽或主推品种，根据品种、蔗地、植期分类，随机取样，共采集80个样本。其中耿马镇采集了29个样本，贺派乡采集了30个样本，四排山乡采集了21个样本。品种上，采集了22个粤糖93-159样本，8个新台糖22号样本，9个柳城05-136样本，8个盈育91-59样本，6个粤糖83-88样本，4个云瑞06-189样本，4个云瑞07-1433样本，3个云瑞10-328样本，7个云蔗05-51样本，9个云蔗08-1609样本。植期上，采集了1年植期样本10个，2年植期样本17个，3年植期样本24个，4年植期样本25个，5年植期样本3个和7年植期样本1个。

每个样本取10株，每株截取中下部茎节各1节，每节切成约7 cm长，纵向“十”字剖为4份，再用钳子挤压蔗茎，共取约25 mL的蔗汁于50 mL离心管内混匀，样品放于冰箱中，于-20℃保存待用。每取1个样品后，取样工具先用清水冲洗，再用75%酒精进行消毒。RSD阳性对照由云南省甘蔗遗传改良重点实验室鉴定保存，阴性对照为(50±0.5)℃热水处理2 h的无菌蔗株，空白对照为灭菌去离子水。

1.2 蔗汁总DNA的提取

各样品取4 mL蔗汁，12000 r/min离心10 min，弃上清，沉淀采用北京全式金生物技术有限公司的EasyPure Plant Genomic DNA Kit试剂盒提取蔗汁总DNA，具体步骤参照说明书进行操作。

1.3 RSD分子检测

RSD的PCR分子检测采用Pan等[20]反应体系及扩增程序，即PCR扩增体系20 µL：ddH2O 8.6 µL，2×EasyTaq PCR SuperMix 8 µL(北京全式金生物技术有限公司，AS111-11)，DNA模板3 µL，上下游引物各0.2 µL(20 µg/µL)；扩增程序为：95℃预变性5 min，94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min，35个循环后72℃延伸5 min。Lxx特异性引物Lxxl：5’-CCGAAGTGAGCAGATTGACC- 3’和Lxx2：5’-ACCCTGTGTTGTTTTCAACG-3’，预期扩增片段大小438 bp，委托上海生工生物工程有限公司合成。扩增产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测。

2 结果与分析

2.1 各主产乡镇RSD发生情况

对云南耿马县耿马镇、贺派乡和四排山乡等3个甘蔗主产乡镇宿根矮化病的调查和检测结果表明见表1、图1。耿马蔗区RSD发生普遍。采用RCR法对采集的80个样本进行RSD检测，结果一致。80个样本中61个呈阳性，阳性检出率为76.25%；其中强阳性样本34个，占42.50%；3个甘蔗主产乡镇均检测出RSD，阳性检出率在70.00%～85.71%之间，检出率和强阳性率最高的是四排山乡，分别为85.71%和66.67%；其次是耿马镇、贺派乡，检出率为75.86%、70.00%，强阳性率为31.03%、36.67%(见图2)。

图1 云南耿马甘蔗宿根矮化病(RSD)PCR检测电泳图

图2 各主产乡镇甘蔗宿根矮化病发生情况

表1 云南耿马甘蔗宿根矮化病(RSD)检测结果

2.2 不同品种、植期RSD发生情况

从检测结果看，耿马蔗区粤糖93-159、新台糖22号、粤糖83-88、柳城05-136、盈育91-59、云瑞06-189、云瑞07-1433、云瑞10-328、云蔗05-51、云蔗08-1609等10个主栽或主推品种均发病，发病率在37.50%～100%之间，其中尤以粤糖93-159、粤糖83-88、云瑞07-1433、盈育91-59、柳城05-136发病最重，发病率为77.27%～100%，强阳性率为44.44%～66.67%，其次是新台糖22号、云瑞06-189、云瑞10-328、云蔗05-51和云蔗08-1609，发病率为37.5%～100%，强阳性率为0%～14.29%(见图3)。植期上1、2、3、4、5年均不同程度发病，但几者之间发病率和发病程度都没有明显的规律性差异(见图4)。

图3 不同甘蔗品种宿根矮化病发生情况

图4 不同植期宿根矮化病发生情况

3 小结与讨论

3.1 RSD在云南耿马蔗区普遍发生且危害严重

田间随机采样检测结果表明，地域上，耿马镇、贺派乡和四排山乡等甘蔗主产乡镇都检测出RSD，阳性检出率为70.00%～85.71%，强阳性率为31.03%～66.67%；80个供试样本中61个呈阳性，阳性检出率为76.25%；其中强阳性样品34个，占42.50%。品种上，10个主栽或主推品种的RSD阳性检出率为37.5%～100%，强阳性率为14.28%～66.67%。植期上，1、2、3、4、5年均不同程度发病，阳性检出率为60.00%～91.67%，强阳性率为30.00%～52.94%。由此可见，RSD已在云南耿马蔗区普遍发生且危害严重。

3.2 科学布局温水脱毒健康种苗示范基地

耿马全县境内甘蔗种植面积近2.67万hm2，是云南省甘蔗种植面积最大的县。甘蔗种植区覆盖面广，蔗糖产业是耿马关联度最大、涉及面最广、影响最深的重要支柱产业，也是全县经济发展的一张王牌。本文研究结果表明，RSD在耿马蔗区普遍发生、危害严重，现已成为制约耿马蔗糖产业持续高质量发展、蔗农增产增收和乡村振兴的重大问题。国内外研究结果表明，种植温水脱毒健康种苗, 甘蔗出苗快，分蘖强，株高高，蔗茎粗，新植蔗增产5.01～49.83 t/hm2，宿根蔗增产4.41～30.84 t/hm2，蔗糖分提高0.35%～0.86%，是防治RSD最经济有效的措施[15-19]。因此，在耿马蔗区生产和推广应用温水脱毒种苗是有效防治甘蔗病害，特别是RSD传播，提高甘蔗产量、延长宿根年限最具潜力和效能的重要措施。根据RSD检测结果，耿马蔗区应重点加强粤糖93-159、粤糖83-88、云瑞07-1433、盈育91-59、柳城05-136等易感病品种的温水脱毒种苗生产繁殖和推广应用。同时建立规范化、标准化的甘蔗温水脱毒健康种苗一级种苗圃133.33 hm2，二级种苗圃1333.33 hm2，以进行种苗扩繁，提供每年近6666.67 hm2的脱毒种苗供生产种植。一级种苗圃专用于繁育经温水处理的脱毒种苗，宜选择与糖厂相邻近，交通便利、排灌方便，地势平坦，地块土质、肥力均较好的田块。脱毒种苗摆放1～2天待胚芽硬化后种植(不超过5天)，下种量为120000～150000芽/hm2，双行接顶摆放(与当地常规种植方式相同)。一级苗圃需强化病虫害综合防治，各项操作应由经过培训技术人员担任。在耿马各甘蔗主产乡镇规划建立甘蔗温水脱毒种苗基地二级种苗圃，二级苗圃大量繁育从一级苗圃收获的蔗种，从下种开始直至收获，都应由专业种植大户加强田间管理，专业技术人员定期巡查指导病虫害防治。二级苗圃收获的蔗种即为生产用脱毒种苗，提供蔗农种植。温水脱毒种苗一、二级专用种苗圃扩繁，田间管理按当地生产实际；全程注重病虫监测、种苗纯度检测，种苗砍收、种植全过程，所用工具应经75%酒精液消毒。