骨肉瘤患者血清外泌体中miR-193a和miR-21-5p表达水平及其临床意义

王 平，王华勇，王 浩，雷大军，

(1．枣阳市第一人民医院康复医学科，湖北枣阳 441200；2．枣阳市第一人民医院骨科，湖北 枣阳 441200)

骨肉瘤是最常见的原发性骨恶性肿瘤，其发病高峰与青少年的青春期生长高峰相一致[1]。骨肉瘤通常发生在长骨干骺端的生长板附近，约三分之二的骨肉瘤发生在股骨远端的膝关节周围，其次是胫骨近端，再次为肱骨近端。尽管临床治疗手段不断发展，但复发转移患者的5年生存率仍不足20%[2]。骨肉瘤早期症状隐匿，临床亟须高效灵敏的标志物，以实现骨肉瘤早期诊断和预后风险判断。外泌体是一种大小30～100 nm 的微小脂质囊泡，其内包裹有核酸(包括miRNA)、蛋白质和脂类等，可通过胞吐作用进入细胞微环境，调控多种生物过程[3]。外泌体miRNA 参与肿瘤微环境重建，在骨肉瘤的侵袭转移和发生发展中具有重要调节作用[4-5]。外泌体miRNA 广泛存在于血液、尿液等体液中，可通过非侵入性操作获取，是骨肉瘤诊断和预后预测的重要方法。研究显示，miR-193a和miR-21-5p 在促进骨肉瘤增殖转移和化疗耐药中发挥重要作用[6-8]。本研究通过对112 例骨肉瘤患者和100例健康体检者血清外泌体miR-193a 和miR-21-5p 表达水平进行检测，拟探讨血清外泌体miR-193a 和miR-21-5p在骨肉瘤诊断和预后预测中的临床意义。

1 材料与方法

1.1 一般资料

选取2016年1月—2021年12月于枣阳市第一人民医院骨科就诊的骨肉瘤患者112 例为骨肉瘤组。纳入标准：①病理确诊为骨肉瘤；②抽血检查前未接受手术或者放化疗；③无合并其他系统疾病；④临床病例资料完整。排除标准：①合并代谢性骨病或其他骨组织疾病；②伴有其他器官功能障碍；③病例失访。同期选取该院体检中心，100 例年龄性别匹配的健康体检者作为健康组，对两组人群进行血清外泌体检测，并收集骨肉瘤组患者的年龄、性别、肿瘤直径和TNM分期等临床资料。本研究112例骨肉瘤患者中18周岁以下患者78 例，发病部位为股骨远端患者68 例，肿瘤直径＜8 cm[9]的患者84 例，病理类型为普通型78例，组织学分类为G1 级别者82 例。本研究经枣阳市第一人民医院伦理委员会审批同意(批准文号为20170312)。

1.2 血清外泌体分离与鉴定

取受试者外周血5 mL，分离血清。利用外泌体提取试剂盒(广州锐博生物公司)进行外泌体提取，将富集纯化后的外泌体4 ℃保存。将分离提纯的血清外泌体进行醋酸双氧铀水染色，利用透射电镜观察外泌体形态，并进一步利用Western blot 检测外泌体特异性标志蛋白CD9 和CD63 的表达，保证分离提纯外泌体的可靠性。CD9 和CD63 的抗体，均购自英国Abcam公司。Western blot具体操作步骤：①使用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离提纯的外泌体蛋白质；②将分离的蛋白质转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上；③进行一抗CD9(1∶1000)和CD63(1∶1500)抗体孵育，内参对照蛋白为GAPDH；④进行二抗孵育；⑤目标蛋白条带发光显示。

1.3 血清外泌体中miRNA提取与qPCR检测

外泌体miRNA 提取试剂盒(DP501)购自德国Qiagen公司，按照试剂盒说明书进行外泌体miRNA提取，利用反转录cDNA 试剂盒(RR037Q，日本TaKaRa公司)将总miRNA 反转录为cDNA，并使用SYBR Green Mix(日本TaKaRa)和C1000系统(美国Bio-Rad)进行实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR，qPCR)检测。选择50 μL 扩增体系(上下游引物各2 μL，DNA 聚合酶2.5 U，10×缓冲液和dNTPs 4 μL，ddH2O 补齐至50 μL)，每个样本重复检测3 次，结果取平均值。用U6 作为miRNA 定量检测的内参[10]，采用2-ΔΔCT计算miR-193a 和miR-21-5p 的相对表达量。miR-193a、miR-21-5p 和U6 的引物序列设计、合成由擎科公司完成，序列(5′-3′)如下：miR-193a，F-TTCAACAACGTCCACCAA，R-CCAGACTCCGGTGT AGAC；miR-21-5p，F-AACTGCAGGCACTCGTTC，RTGCTGGAAGAGGTCGGTA；U6，F-AGCATTACTAAA ATTGAACAT，R-ACTGCAGGGTCCGAGGTATT。

1.4 统计学分析

应用SPSS 26.0 进行统计分析，采用GrapPad Prism 8 绘制图形。计量资料采用xˉ±s表示，采用Wilcoxon 秩和检验进行两组间比较；计数资料采用卡方检验进行两组间比较。利用受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve，ROC)下面积(area under curve，AUC)评估诊断效能。以约登指数取最大时，对应的指标值定义为截断值，并计算该指标诊断的灵敏度和特异度。以α=0.05为检验水准。

2 结 果

2.1 血清外泌体鉴定

分离提纯的血清外泌体在透射电镜下可见囊状脂质双层膜结构，直径约为100 nm(图1A)。Western blot检测结果显示CD9和CD63在血清提纯的外泌体中高表达(图1B)。

2.2 血清外泌体中miR-193a 和miR-21-5p 表达水平的分析

血清外泌体中miR-193a 和miR-21-5p 表达水平的分析结果见图2，显示骨肉瘤组血清外泌体中miR-193a和miR-21-5p表达水平均显著高于健康对照组(P＜0.01)。

图2 血清外泌体中miR-193a和miR-21-5p表达水平的差异分析

2.3 血清外泌体中miR-193a 和miR-21-5p 对骨肉瘤诊断价值的分析

分别以血清外泌体中miR-193a 和miR-21-5p 的表达量及两者联合预测值，进行骨肉瘤诊断，通过ROC曲线和AUC值进行诊断效能评估。结果见表1和图3，miR-193a 和miR-21-5p 联合诊断骨肉瘤的AUC为0.901，高于单一指标诊断效能。

表1 血清外泌体miRNA诊断骨肉瘤效能分析

图3 miR-193a、miR-21-5p及二者联合诊断骨肉瘤的ROC曲线

2.4 血清外泌体miR-193a 和miR-21-5p 表达水平与临床特征的相关性分析

骨肉瘤血清外泌体中miR-193a 和miR-21-5p 表达水平，与骨肉瘤患者的年龄、性别和发病部位无明显相关(均P＞0.05)，与肿瘤直径、组织学分级、Enneking分期、远处转移和是否手术治疗明显相关(均为P＜0.05，见表2)，提示miR-193a和miR-21-5p可能与骨肉瘤的发展和转移相关。

表2 血清外泌体miR-193a 和miR-21-5p 表达水平与临床病理指标分析

2.5 骨肉瘤患者不同临床特征和血清外泌体中miR-193a、miR-21-5p表达水平的预后分析

为探索不同临床特征和血清外泌体中miR-193a、miR-21-5p 表达对患者预后的影响，我们进行了单因素Cox分析，结果见表3，显示肿瘤直径＞8 cm，组织学分级G2、Enneking 分期IIB～III 期、伴有远处转移、未进行手术治疗，以及血清外泌体中miR-193a、miR-21-5p 高表达是患者预后的危险因素(均为P＜0.05)；而患者年龄、性别和肿瘤部位对预后无显著影响(均为P＞0.05)。

表3 不同临床变量和血清外泌体miR-193a、miR-21-5p关系的单因素Cox分析

进一步利用Kaplan-Meier 生存曲线，分析血清外泌体中miR-193a 和miR-21-5p 表达水平对骨肉瘤患者预后的影响。结果见图4，显示miR-193a 和miR-21-5p 高表达组的骨肉瘤患者，总体生存率显著低于低表达组患者(均为P＜0.05)。此结果提示miR-193a 和miR-21-5p可预测骨肉瘤患者预后。

图4 血清外泌体miR-193a和miR-21-5p与骨肉瘤患者预后生存分析

3 讨论

骨肉瘤是一种恶性程度高、侵袭性较强的原发性骨恶性肿瘤。尽管临床诊断和治疗手段不断进步，仍有约1/5的患者就诊时即伴有远处转移[2]，临床亟须高效的诊断和预后预测标志物。血清外泌体及其内包裹的miRNA，可调控肿瘤微环境，影响肿瘤发生发展和侵袭转移[5]。检测外泌体中特定miRNA 的表达水平，可辅助骨肉瘤鉴别诊断和预测患者预后。

研究表明，miRNA在多种肿瘤中异常表达，在肿瘤发生和进展中起着重要作用[11-12]。miR-21-5p 位于人类染色体的17q23.2，具有原癌基因特性[13]。miR-21-5p 可通过与靶基因的相互作用，调控肿瘤细胞增殖[12]。在骨肉瘤中，miR-21-5p 表达上调，与临床病理指标密切相关，可作为骨肉瘤患者预后不良的生物标志物[14-15]。miR-193a 在食管癌、胃癌和结直肠癌等肿瘤中表达上调[16-18]。研究显示，miR-193a 表达与膀胱癌的多药耐药性相关[19]。在骨肉瘤中，Jacques 等[20]研究发现，miR-193a 通过抑制TAp73β，增加顺铂耐药，miR-193a 表达促进骨肉瘤细胞系的迁移和侵袭。miR-193a-5p 在骨肉瘤组织中显著上调，可促进骨肉瘤细胞(SaOS2 和U2OS)的增殖、迁移、侵袭和上皮间质转化，以及小鼠异种移植物模型中的转移[8]。外泌体来源的miRNA对肿瘤微环境形成具有重要作用，骨肉瘤中外泌体来源的miR-21-5p高表达，促进肿瘤抑制性微环境形成[21]。人骨髓间充质干细胞中外泌体来源的miR-21-5p 可通过抑制骨肉瘤细胞中PIK3R1 的表达，激活PI3K/Akt/mTOR 通路，进而增强骨肉瘤细胞的增殖和侵袭[7]。本研究中骨肉瘤患者血清外泌体miR-21-5p 和miR-193a 表达水平显著高于健康对照组，且与高的转移风险和更差的预后相关。此外，血清外泌体miR-2-5p 在骨肉瘤诊断方面同样具有较好的诊断效能、灵敏度和特异度。血清外泌体miR-193a和miR-21-5p 两者联合，可显著提高骨肉瘤诊断效能，AUC 值达0.901，具有较高的诊断准确度。此结果提示miR-193a 和miR-21-5p 表达对骨肉瘤诊断和临床预后预测具有重要价值，但仍需要大样本、多中心、前瞻性临床队列进行验证。此外，血清外泌体miR-193a和miR-21-5p表达，对骨肉瘤发生发展的具体分子机制，仍需要进一步在细胞及动物实验上进行研究。

综上，本研究发现骨肉瘤患者血清外泌体miR-193a 和miR-21-5p 表达水平显著高于健康对照组，且miR-193a 和miR-21-5p 表达高的患者往往伴有更晚的TNM 分期、远处器官转移风险和更差的预后。血清外泌体miR-193a 和miR-21-5p 有望成为骨肉瘤诊断和预后预测的生物标志物。