ICG-001对食管鳞癌细胞增殖的抑制作用及其分子机制

史建红，陈丁雄，卢晓童，郝佳洁，蔡 岩，王明荣，张 钰

(国家癌症中心/国家肿瘤临床医学研究中心/中国医学科学院北京协和医学院肿瘤医院，分子肿瘤学国家重点实验室，北京 100021)

食管癌是常见的消化系统恶性肿瘤，我国是世界上食管癌发病率和死亡率最高的国家。统计数据显示，2016年食管癌的发病数和死亡数分别位居我国恶性肿瘤的第6 位和第4 位[1]。食管鳞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)是我国食管癌的主要病理类型，其预后差，死亡率高，多年来中晚期患者术后的5年生存率一直徘徊在15%～25%[2]。目前临床上尚缺乏可高效治疗ESCC 的药物，因此迫切需要寻找新的有效药物。

Wnt/β-catenin 信号通路在细胞增殖、分化、凋亡、侵袭、迁移、上皮-间质转化和肿瘤干细胞的自我更新等过程中发挥重要作用[3]。既往研究表明，Wnt/β-catenin 信号通路的异常激活与ESCC、肝癌和结直肠癌等实体肿瘤及血液系统恶性肿瘤的发生、发展及预后密切相关[4-7]，提示Wnt/β-catenin信号通路是相关恶性肿瘤治疗的潜在靶点。ICG-001 是Wnt/β-catenin信号通路的一种小分子抑制剂，主要通过竞争性结合CREB 结合蛋白(creb-binding protein，CBP)从而干扰CBP 与β-catenin 的相互作用，由此抑制β-catenin/TCF 对下游靶分子的转录活化[8]。目前，已有多项研究证实ICG-001 可显著抑制结直肠癌、胰腺导管腺癌、唾液腺肿瘤和急性淋巴细胞白血病等多种恶性肿瘤细胞在体内、外的增殖能力[8-11]。然而，ICG-001 在ESCC 中的作用目前尚无文献报道。因此，本研究检测分析了ICG-001 对ESCC 两种细胞系KYSE410和KYSE450细胞增殖能力、细胞凋亡及周期分布的影响，并通过检测相关分子的mRNA 和蛋白表达水平的变化探讨其作用的分子机制。

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器

细胞培养基RPMI-1640 为Cell Technology 公司产品。胎牛血清购自Newzerum公司，SDS-PAGE凝胶配制试剂盒购自美仑生物公司。Opti-MEM 培养基购自Gibco 公司。Lipofectamine 2000 转染试剂、BCA 蛋白定量试剂盒、ECL 化学发光检测试剂购自Thermo Fisher Scientific 公司。CCK-8 细胞增殖检测试剂盒、细胞凋亡检测试剂盒和细胞周期检测试剂盒均购自日本同仁化学公司。细胞RNA提取试剂盒购自南京诺唯赞生物公司。TB Green®Premix Ex TaqTM试剂盒购自日本TaKaRa 公司。HiFiScript cDNA 合成试剂盒购自北京康为世纪公司。SKP2、Survivin和TCF4抗体购自CST 公司，GAPDH 抗体购自Proteintech 公司。DMSO购自Sigma 公司。抑制剂ICG-001 购自Selleck 公司。电泳仪和实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR，qPCR)仪购自Applied Biosystems 公司。湿转转膜仪购自Tanon 公司。酶标仪购自Bio Tek Instrument公司。化学发光成像仪购自Beckman公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 食管鳞癌细胞系KYSE410 和KYSE450购自南京科佰生物公司，均使用添加10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素和0.1 mg/mL 链霉素的RPMI-1640培养基，置于CO2体积分数为5%的恒温培养箱中37 ℃进行培养。

1.2.2 细胞增殖实验 在96孔板中每孔接种3000个对数生长期的细胞，每组设3 个平行复孔。待细胞完全贴壁后，分别用25、50和100 μmol/L的ICG-001处理细胞24 和48 h 后使用CCK-8 试剂盒检测细胞增殖活力，获得D(450)值，以DMSO 处理细胞作为对照组，并按以下公式计算细胞增殖率。

1.2.3 平板集落形成实验 在6 孔板中每孔接种1000个对数生长期的细胞，并分别用50和100 μmol/L的ICG-001处理KYSE410和KYSE450细胞进行平板集落形成实验。每组设3 个平行复孔。当出现肉眼可见的克隆时，终止培养，甲醇固定后用0.5%结晶紫染液染色并计数。

1.2.4 细胞周期检测 分别使用50 和100 μmol/L 抑制剂ICG-001 处理KYSE410 和KYSE450 细胞24 h 后收集细胞沉淀，用70%乙醇固定过夜，用含RNA酶的PI染色，使用流式细胞仪进行检测，并用Modifit软件进行数据分析，以DMSO处理细胞作为对照组。

1.2.5 细胞凋亡检测 细胞分组同1.2.4。使用抑制剂ICG-001处理48 h后收集细胞，按照细胞凋亡检测试剂盒说明书进行操作。使用流式细胞仪进行检测，用Flowjo.10软件作图。

1.2.6 qPCR 检测 细胞分组同1.2.4。ICG-001 处理24 h 后收集细胞，使用RNA 提取试剂盒提取总RNA，使用HiFiScript cDNA 合成试剂盒合成cDNA。使用TB Green®Premix Ex TaqTM试剂盒及ABI Quant-Studio 5 PCR仪进行qPCR实验。qPCR 20 μL扩增体系为：cDNA 模板2 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL，ROX 染料II 0.4 μL，2×TB Green 10 μL，RNase-Free 水6.8 μL。qPCR 反应程序：95 ℃、30 s；95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，95 ℃、15 s，40 个循环；60 ℃、1 min→95 ℃、15 s。以GAPDH基因mRNA 表达水平为参照对数据进行归一化处理，采用2-ΔΔCT法计算基因的相对表达量。引物使用Primer Premier 5.0软件设计后由北京天一辉远生物科技有限公司合成，引物序列(5′-3′)如下：Survivin，F-GCCCAG TGTTTCTTCTGCTT，R-TCCGCAGTTTCCTCAAATTC；SKP2，F-ATGCCCCAATCTTGTCCATCT ，R-CACCGA CTGAGTGATAGGTGT；GAPDH，F-ACCCACTCCTCCA CCTTTGA，R-CATACCAGGAAATGAGCTTGACAA。

1.2.7 蛋白提取和Western blot 检测 ICG-001 处理24 h后收集细胞，使用含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA 裂解液裂解细胞提取总蛋白，使用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量。按照常规方法进行SDS-PAGE 电泳并转移至PVDF 膜上，用5%脱脂牛奶封闭1 h 后加入一抗4 ℃孵育过夜。一抗包括：β-catenin、SKP2、Survivin、TCF4 和GAPDH，使用5%脱脂牛奶按1∶1000 进行稀释。使用洗涤缓冲液TBST洗涤3次，每次8 min，加入对应种属的二抗(5%脱脂牛奶按1∶5000 进行稀释)，室温摇床孵育1 h，TBST 洗涤3 次，每次8 min，配制ECL 发光液，使用Amersham Imager 800成像仪进行曝光，以GAPDH 作为内参对照。

1.3 统计学分析

应用SPSS Statistics 23.0 软件对数据进行统计学分析，使用GraphPad Prism 8.0 软件进行图片制作。用单因素方差分析法(one-way ANOVA)进行多样本均数的比较。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 ICG-001抑制ESCC细胞的增殖活力

CCK-8 细胞增殖活力实验结果显示，ICG-001 处理24或48 h可抑制ESCC细胞系KYSE410和KYSE450的增殖活力，并呈剂量依赖性(P＜0.01，图1)。

图1 ICG-001处理24或48 h对ESCC细胞增殖活力的影响

2.2 ICG-001抑制ESCC细胞的集落形成能力

平板集落形成实验结果显示，50和100 μmol/L的ICG-001 处理48 h 可显著抑制ESCC 细胞系KYSE410和KYSE450的集落形成能力(P＜0.01，图2)。

图2 ICG-001处理48 h对ESCC细胞集落形成能力的影响

2.3 ICG-001诱导ESCC细胞发生G0/G1期阻滞

流式细胞术分析结果显示，KYSE410和KYSE450细胞经ICG-001 处理24 h 后，G0/G1 期细胞比例显著增加，S 期和G2/M 期细胞比例相对降低(图3)，提示ICG-001 可诱导ESCC 细胞发生G0/G1 期阻滞(P＜0.01)。同时，我们也检测了ICG-001 处理细胞的凋亡情况，但未见到ESCC 细胞发生明显凋亡(结果未展示)。

图3 ICG-001处理24 h对ESCC细胞周期分布的影响

2.4 ICG-001对β-catenin通路相关分子表达的影响

qPCR 检测结果显示，在ICG-001 处理的ESCC 细胞中，β-catenin/TCF 下游靶分子SKP2 和Survivin 的mRNA表达水平与对照组相比显著降低(P＜0.01)，而且可与β-catenin 结合的转录因子TCF4 的mRNA 表达水平也明显降低(P＜0.01，图4)。Western blot 检测结果显示，SKP2、Survivin和TCF4的蛋白表达水平均明显下调(P＜0.01，图5)。

图4 ICG-001对β-catenin通路下游分子mRNA表达水平的影响

图5 ICG-001对β-catenin通路相关蛋白表达的影响

3 讨论

ICG-001 可以有效抑制多种恶性肿瘤细胞的增殖。但迄今为止，ICG-001在ESCC中的作用尚无文献报道。本研究结果显示，ICG-001 处理可显著抑制ESCC 细胞的增殖能力。这与以往研究在结肠癌、胰腺导管腺癌、胃癌、葡萄膜黑色素瘤和鼻咽癌细胞中所观察到的现象一致[8-9，12-14]。我们进一步分析发现，ICG-001可诱导ESCC细胞发生G0/G1期阻滞，但并未见到明显的细胞凋亡。与本文结果相似的是，Michael等[8-9，12]在胰腺导管腺癌、结肠癌和胃癌细胞中的研究结果也显示ICG-001 可以诱导细胞发生G0/G1 期阻滞。同时，在胰腺导管腺癌细胞中ICG-001 也是主要通过诱导G0/G1 期阻滞抑制细胞增殖，但对细胞存活无明显影响[9]。而在结肠癌和胃癌细胞中，ICG-001不仅可以诱导细胞周期阻滞，同时也诱发了明显的细胞凋亡[8，12]。

既往文献报道ICG-001可以抑制β-catenin 的转录活性[8]，为进一步探讨ESCC 细胞中ICG-001作用的分子机制，我们检测分析了ICG-001 处理细胞后β-catenin 通路相关分子的表达变化情况，发现β-catenin信号通路下游分子SKP2和Survivin的表达明显下调。以往有多项研究显示抑制SKP2 表达可导致G0/G1期阻滞[15-16]，本研究结果亦提示ICG-001可能通过下调SKP2 的表达将ESCC 细胞阻滞在G0/G1 期，但其作用的详细机制还有待深入研究。另一方面，有研究显示ICG-001 可通过下调Survivin 诱导结肠癌和多发性骨髓瘤细胞发生凋亡[8，17-19]。但是，在本研究和另一项关于胰腺导管腺癌的研究中，虽然ICG-001 处理下调了Survivin 的表达水平，但细胞并未发生明显凋亡[9]。我们推测这两类细胞中可能存在某些负反馈调节，但相关分子机制目前尚不清楚。

据文献报道，β-catenin 可与TCF4 结合形成转录因子复合物激活SKP2和Survivin等靶基因的转录[9，20-21]。在本研究中，我们还发现ICG-001处理可导致转录因子TCF4 的mRNA 和蛋白表达水平明显下调。因此，我们推测ICG-001 除了干扰β-catenin 和CBP 结合，还可能通过下调TCF4 的表达进而抑制β-catenin/TCF 复合物的功能，导致SKP2和Survivin的表达水平降低。目前，ICG-001对TCF4表达的影响尚未见到文献报道，相关调控机制仍有待于进一步研究阐明。

综上所述，本研究结果显示，ICG-001 可显著抑制ESCC 细胞的增殖潜能，提示ICG-001 可通过影响β-catenin/TCF 复合物的功能从而抑制下游靶分子Survivin 和SKP2 的表达，诱导细胞发生G0/G1 期阻滞进而抑制ESCC 细胞的增殖。目前临床上缺乏疗效显著的ESCC 治疗药物，亟须研发有效的治疗药物和治疗方案。本研究结果提示ICG-001 是潜在的ESCC 治疗药物，将其单独或联合其他治疗手段有可能提高临床疗效。后续研究将进一步检测ICG-001 对ESCC 细胞移植瘤增殖的抑制作用，在体内模型中验证其治疗潜力，以期为ESCC 的治疗提供新的候选药物及实验依据。