双酚S对秀丽隐杆线虫精子生成相关基因表达的影响

唐 娇，谭剑斌，茅莉娜，张紫虹，李文立，胡帅尔，赵 敏，

(1．广东省公共卫生研究院健康风险评估研究室，广东 广州 511430；2．广东省疾病预防控制中心卫生毒理所，广东 广州 511430；3．广东省生物制品与药物研究所药理研究室，广东 广州 510440)

双酚S 化学名称为4, 4′-磺酰基二苯酚(4,4′-sulfonyldiphenol，BPS)，是双酚A 的结构类似物。毒理学研究和人群流行病学调查证明双酚A具有雌激素作用，对生殖系统、肝脏具有一定损伤作用[1]，被禁止用于食品包装材料[2-3]，双酚S 由于具有耐热、耐光、抗氧化等性能而成为双酚A最普遍的替代物用于食品包装材料[4]。然而，近年研究发现，在油脂、酸性或外界环境的影响下，包装材料中的双酚S 极易迁移至食品中，导致人体生物样本中双酚S 的检出率逐年上升，人群暴露水平呈递增趋势[5]。双酚S的安全性及人群暴露风险受到越来越多的关注。秀丽隐杆线虫由于遗传背景清晰，与人类基因同源性高，符合国际要求的“3R”原则等多种优点，成为评价食品毒理效应及机制探讨的理想模式生物[6]。因此，本实验以秀丽隐杆线虫为研究对象，探讨双酚S 对线虫精子生成相关基因表达的影响，为双酚S 的安全性研究资料提供有益补充。

1 材料与方法

1.1 主要材料和仪器设备

双酚S(CAS：80-09-1)购自阿拉丁公司，纯度99%；秀丽隐杆线虫N2 野生型、大肠杆菌OP50由华南农业大学植物病理学教研室惠赠；Trizol 试剂、cDNA反转录试剂盒、SYBR Green半定量PCR试剂盒购自碧云天生物技术有限公司；CFX96 Touch 实时荧光定量PCR(quantitative real-time， qPCR) 仪(Bio-Rad，美国)；生化培养箱(ZHUJIANG LRH-250A)购于广东泰宏君公司；电热恒温培养箱(DHP-9052)购于中仪国科(北京)科技有限公司；涡旋振荡器(IKA，德国)；高速离心机(Thermo Fisher Scientific，美国)；体视显微镜(Nikon SMZ745，日本)；细胞组织破碎仪(Bullet Blender Gold，Next Advance，美国)。

1.2 试验方法

1.2.1 剂量设计 将双酚S 溶解于二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)中，根据试验设计配置浓度分别为5000、2000、200、20、2 μmol/L的双酚S溶液，溶液中DMSO的终浓度全部为0.2%，进行急性毒性试验，求得半数致死浓度(lethal concentration 50%，LC50)后，以1/1000、1/100 和1/10 的LC50浓度分别为约3、30 和300 μmol/L 进行子代数目和精子生成相关基因表达的测定试验。

1.2.2 秀丽隐杆线虫同步化 用S缓冲液将体内含有大量虫卵的成虫从线虫生长培养基(nematode growth medium，NGM)冲洗至15 mL 离心管中，反复冲洗两次以洗去线虫身上的大肠杆菌OP50，弃上清，将配置好的碱性裂解液(4%的NaClO、2 mol/L 的NaOH、灭菌水体积比为1∶1∶1)按线虫体积等比例加入离心管中，边振荡边观察，至虫体全部裂解，离心去上清，将虫卵用S缓冲液反复冲洗3次，取100 μL沉淀接种到涂布有大肠杆菌OP50的NGM培养基上，放入20 ℃生化培养箱过夜得到L1 期线虫，继续培养约48 h，得到L4期线虫。

1.2.3 急性毒性试验 在96 孔板上加入不同浓度双酚S 溶液200 μL，每个浓度设3 个平行孔，然后用挑针在每孔中加入约40 条L4 期线虫，记录受试虫数(n总)。染毒24 h，用显微镜观察每孔线虫状态，记录线虫死亡数目(n24h)。线虫死亡的判断标准：咽泵停止运动，用铂丝多次触碰虫体无反应。

死亡率(%)=n24h/n总×100%。

1.2.4 子代数目的测定 挑取同步化培养至L4 期的雌雄同体线虫到涂布有不同浓度双酚S的NGM培养基上，进行24 h暴露。暴露结束后，在每个平板中挑取1只待测的线虫，放入20 ℃生化培养箱培养。在产卵期内每天将线虫转移到一个新的平板上，含有虫卵的旧平板继续放置在20 ℃生化培养箱培养24 h，然后对每个平板上的线虫数目进行统计，待线虫排卵期结束，将每个平板线虫数目相加，计算每条线虫总的子代数目。

1.2.5 精子生成相关基因测定 使用qPCR 检测精子生成相关基因的表达。将同步化培养至L4期线虫分别在涂布有不同浓度双酚S的NGM培养基上，进行24 h暴露后，采用Trizol 法提取线虫的总RNA，然后逆转录成cDNA进行qPCR。引物根据线虫数据库的序列以及美国国家生物技术信息中心进行设计，具体引物序列见表1。反应体系为：SYBR Green qPCR Mix(2×，High ROX) 10 μL，上、下游引物(3 μmol/L)各1 μL，去离子水7 μL，cDNA 1 μL，组成20 μL 反应体系。扩增步骤为：95 ℃预变性2 min，95 ℃、15 s，60 ℃退火30 s，采集荧光信号，40 个循环，72 ℃、30 s延伸，act-1作为参考基因，使用2-ΔΔCT法分析比较akt-1、swm-1、try-5、spe-4、spe-6基因的mRNA相对表达水平。

表1 精子生成相关基因的引物序列(5′-3′)

1.3 统计方法

所有实验均重复3次，采用SPSS 18.0软件对数据进行统计学分析，急性毒性试验采用概率分析(probit analysis-Spearman)，计算线虫双酚S 染毒24 h 后的LC50；计量资料用xˉ±s表示，采用单因素方差分析，两两比较选择Dunnett-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 双酚S对秀丽隐杆线虫的急性毒性试验

经24 h暴露得到不同浓度双酚S对秀丽线虫的致死数据，如表2 所示。利用SPSS 软件中的PROBIT 模块进行计算，根据3 次毒性试验结果，取3 次平均死亡率进行分析，可得到双酚S 暴露24 h 的LC50为2773.672 μmol/L，故后续以1/1000、1/100 和1/10的LC50浓度分别为约3、30 和300 μmol/L 进行子代数目和精子生成相关基因表达的测定。

表2 双酚S经24 h暴露后秀丽隐杆线虫死亡率

2.2 双酚S 暴露24 h 对秀丽隐杆线虫子代数目的影响

3、30 和300 μmol/L 双酚S 作用24 h 后秀丽隐杆线虫子代数目分别为197.6±32.4、184.5±39.5和180.4±42.9，与阴性对照组的(226.1±34.6)相比，各剂量组子代数目均明显下降，差异均有统计学意义(P＜0.05 或0.01)。

2.3 双酚S 暴露24 h 对秀丽隐杆线虫精子生成相关基因mRNA表达的影响

将数值标准化，阴性对照组的基因表达水平定义为1。如表3所示，与阴性对照组相比，当双酚S浓度为3 μmol/L 时，akt-1基因mRNA 表达水平上调(P＜0.05)；当双酚S 浓度为30、300 μmol/L 时，swm-1、try-5、spe-4、spe-6基因的mRNA 表达水平上调(P＜0.05或0.01)。

表3 不同浓度双酚S暴露24 h后秀丽隐杆线虫精子生成相关基因mRNA的相对表达水平

3 讨论

双酚S 由于成为双酚A 的替代物在食品包装中广泛使用，使其安全性得到广泛关注。目前研究表明，双酚S 具有内分泌干扰活性、遗传毒性，对哺乳动物及斑马鱼有生殖毒性和发育毒性[7-8]。生殖毒性方面，文献报道双酚S 可以通过氧化应激途径介导生精细胞凋亡和类固醇激素合成障碍，从而导致生殖系统功能障碍[9]。本文以秀丽隐杆线虫作为模式生物，研究双酚S对精子生成相关基因的影响。

本研究经过急性暴露试验得到双酚S 的LC50为2773.672 μmol/L(换算后为694 mg/L)，与之前文献报道的545.59 mg/L在一个数量级[10]。在评价生殖能力方面，子代数目是N2 野生型秀丽隐杆线虫的经典指标，主要考察的是秀丽隐杆线虫的繁殖能力。本研究表明双酚S 在3、30、300 μmol/L 剂量时均可引起子代数目降低，并与对照组相比差异有统计学意义。之前也有文献报道当双酚S剂量为0.01 μmol/L时，秀丽隐杆线虫的子代数目显著降低[10-11]，提示双酚S暴露后可能导致秀丽隐杆线虫的生殖细胞受损而引起繁殖能力下降。生殖细胞生成精细胞，精细胞成为有活力可以受精的精子，这些过程受多种信号通路的调控。在观察影响的基因时，本文选取了精子发生相关基因akt-1和精子形成相关基因swm-1、try-5、spe-4、spe-6[12]。因为akt-1属于Insulin/IGF通路，该通路是精子发生过程中关键的调控通路之一[13]。实验表明尽管线虫暴露在3 μmol/L 双酚S 时，可以使akt-1 mRNA的表达量增加(P＜0.05)，但随着双酚S 剂量的增加，mRNA 的表达量开始下调，但与对照组相比差异并无统计学意义。说明双酚S 对秀丽隐杆线虫的精子生成影响并不是通过基因akt-1的表达进而影响Insulin/IGF通路导致的，在后续试验中还需要验证该通路中的其他受体基因，进一步确定双酚S 是否介导该通路而影响精子发生引起子代数目降低。swm-1 信号通路是调节精子形成过程的关键通路之一[14-15]；try-5 使秀丽隐杆线虫的精子在合适的时间活化[16]；spe-6是类酪蛋白激酶1 蛋白，在精子发生过程中影响精细胞的分裂，精子形成的发动需要下调spe-6 蛋白的表达，同时也在精子活化方面发挥作用[17-19]；spe-4可以抑制精子的活化[20]。实验结果表明，与对照组相比，双酚S 暴露后精子形成相关基因swm-1、try-5、spe-4、spe-6 表达量均上升，导致精子活化异常，从而导致生殖能力降低。在后期研究中，将利用雄性突变体秀丽隐杆线虫进一步验证。