肺腺癌胸腔积液DNA倍体异常与EGFR突变的关系及其对患者预后的影响

刘 颖，王 蕊，郭 晓，董律吏，张 艳，赵银环，杜 芸

(河北医科大学第四医院癌检中心，河北石家庄 050011)

肺癌是导致癌症相关死亡的主要原因[1-2]，肺腺癌是肺癌中最常见的病理类型。晚期肺腺癌患者往往具有胸腔积液转移，转移性肿瘤细胞恶性程度越高，染色体越不稳定，DNA倍体异常细胞越多。应用计算机辅助DNA 倍体分析可以测定肿瘤细胞核的DNA 含量，计数胸腔积液中DNA倍体异常细胞。肺腺癌中最常见的驱动基因突变是表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)，在亚洲人中EGFR突变率为40%～62%[2]。EGFR突变状态与肺腺癌生物学行为及预后相关，然而研究结果并不一致。DNA倍体异常通常用于辅助细胞病理学的诊断，已有研究表明DNA 倍体异常可能影响肺腺癌患者的预后[3]，DNA 倍体异常与肿瘤增殖密切相关，肿瘤细胞增殖一般伴有染色体数量和结构异常[4]，但对于DNA 倍体异常与EGFR突变之间的关系却少见报道。本研究将肺腺癌患者胸腔积液中的肺腺癌细胞用于DNA倍体分析和基因检测，分析癌细胞的DNA 倍体异常和EGFR突变之间的关系，并探究其对患者预后的影响。

1 材料与方法

1.1 病例收集

本研究采用回顾性分析来自河北医科大学第四医院2012年1月—2019年12月期间439例肺腺癌患者的临床资料。患者的入选标准包括：①经细胞病理学诊断及免疫细胞化学确诊为胸腔积液肺腺癌转移；②单发肺癌；③有明确的DNA 倍体分析及EGFR基因突变检测结果。所有患者均随访至死亡或研究截止日期(2019年12月31 日)，统计患者的总生存期(overall survival，OS)，即确诊肺腺癌至患者出现死亡或本研究截止日期。本研究经过河北医科大学第四医院伦理委员会批准(批准文号2019MEC102)，且临床资料收集均已获得患者知情同意书。吸烟史定义为入院前平均每天吸烟≥1支，且持续时间超过6个月。

1.2 胸水的处理

用一次性细胞采集器富集胸腔积液中的肿瘤细胞，制作涂片，进行HE 染色。并采用免疫细胞化学法[5]，选择NapsinA、TTF1、P40、P63、Syn、CD56、CEA、WT1等抗体诊断肺腺癌胸腔积液转移。本实验所有抗体均为即用型抗体，均购自福州迈新公司。

1.3 计算机辅助DNA倍体分析

制作胸腔积液涂片进行Feulgen 染色，使用购自武汉兰丁的计算机辅助DNA图像定量分析系统(DNAICM)检测染色细胞核的集成光密度(integrated optical density，IOD)来测定细胞核DNA 含量，用DNA 指数(DNA index，DI)来表示DNA含量[6]。DI为肿瘤细胞核DNA均值与正常细胞DNA均值的比值，它反映了肿瘤细胞总DNA含量的相对水平。DI计算公式如下：

正常细胞的DI 是2c(1c 为正常G0/G1 组DNA 含量的一半，因此G0/G1 细胞为2c 细胞，即二倍体细胞)。大于5c 细胞(5 倍体细胞)被判断为DNA 倍体异常细胞。计算大于5c 细胞的百分比，即DNA 含量大于5c的细胞数量/DNA 含量大于2c 的细胞数量×100%；大于9c 细胞的数目，即前20 个细胞中大于9c 的细胞数；大于5c 细胞的平均DI 值，即前20 个细胞中大于5c细胞的平均DI值。

非整倍体细胞峰为在2c以后可出现大量非整倍体细胞，并形成峰，根据形成峰的多少可分为无峰、单峰、双峰和多峰。

1.4 EGFR突变检测

利用人类EGFR基因突变检测试剂盒(厦门艾德公司)，通过ABI 7500荧光定量PCR仪(美国Thermofisher公司)，采用扩增受阻突变系统-PCR 技术(amplification refractory mutation system，ARMS)对从胸腔积液肿瘤细胞中提取的DNA 进行扩增，检测EGFR基因突变类型。PCR 反应条件：95 ℃、5 min；95 ℃、25 s，64 ℃、20 s，72 ℃、20 s，15 个循环；93 ℃、25 s，60 ℃、35 s，72 ℃、20 s，36个循环。

1.5 统计学分析

应用SPSS 21.0 软件进行统计分析。采用卡方检验比较分类变量组间分布差异，计数资料用百分比表示，采用秩和检验、卡方检验和Kendall's taub系数评价DNA 倍体异常与EGFR突变的相关性，单因素生存分析用Kaplan-Meier 法及Log-rank 检验，多因素生存分析采用Cox 比例风险模型。以α=0.05 为检验水准。用R语言的最优截断算法来确定连续参数的截断值，选择在生存分析中意义最大的截断值作为最优截断值。

2 结 果

2.1 EGFR基因突变与临床病理指标的相关性

439例肺腺癌患者中，共有244例(55.58%)检测出EGFR突变。其中外显子19缺失100例(40.98%)，外显子21突变113例(46.31%)，其他突变31例(12.7%)。如表1所示，EGFR突变与患者年龄无明显相关关系。男性、有吸烟史、大于5c 细胞的百分比＜14%、大于9c细胞的数目＜8、最大DI 值＜6、大于5c 细胞的平均DI值＜5的患者，其EGFR基因突变率降低(P＜0.05)。非整倍体细胞峰的不同分组间EGFR突变率不同(P＜0.01)，两两比较发现单峰和双峰EGFR突变率高于无峰患者，而多峰患者与其他各峰间EGFR突变率的差异无统计学意义(P＞0.05)。

表1 EGFR基因突变与肺腺癌患者临床病理指标的相关性

2.2 DNA倍体异常与EGFR基因突变的相关性

如表2 所示，Mann-WhitneyU检验结果显示，EGFR突变患者大于5c细胞的百分比、大于9c细胞的数目、最大DI 值、大于5c 细胞的平均DI 值、非整倍体细胞峰数的平均秩次高于EGFR野生型患者(P＜0.01)。Kruskal-WallisH检验结果显示，EGFR各突变组间大于5c 细胞的百分比、最大DI 值、大于5c 细胞的平均DI值、非整倍体细胞峰数间的差异无统计学意义(P＞0.05)，而EGFR不同突变组大于9c细胞的数目经Bonferrni 法校正后两两分析比较发现，21号外显子突变的大于9c 细胞的数目的平均秩次高于其他突变组(P=0.049)。采用Kendall's tau-b相关系数评价DNA 倍体异常和EGFR突变的关系，大于5c 细胞的百分比、大于9c 细胞的数目、最大DI 值、大于5c 细胞的平均DI 值、非整倍体细胞峰数均和EGFR突变均存在较弱的正相关关系(P＜0.05)，Kendall's tau-b分别为0.186、0.153、0.110、0.156、0.148，说明EGFR突变率随DNA倍体异常比例增加而升高。

表2 DNA倍体异常与EGFR基因突变的相关性(平均秩次)

2.3 DNA 倍体异常与EGFR 突变对肺腺癌患者预后的影响

本实验采用OS 作为主要结局指标。如表3 所示，单因素生存分析结果显示，≤62 岁、女性、不吸烟的患者预后好于大于62岁、男性、吸烟的患者；大于5c细胞的百分比≥14%、大于9c细胞的数目≥8的患者预后好于大于5c 细胞的百分比＜14%、大于9c 细胞的数目＜8的患者；EGFR突变型患者的预后较EGFR野生型患者更好。而多因素生存分析结果显示，大于5c细胞的百分比(P=0.171)、大于9c细胞的数目(P=0.176)及性别(P=0.799)与晚期肺腺癌患者预后无明显相关关系；EGFR突变是患者的正向独立预后影响因素，年龄、吸烟是患者的负向独立预后影响因素，如表4所示。

表3 439例肺腺癌患者临床及病理指标的单因素生存分析

表4 439例肺腺癌患者临床及病理指标的多因素生存分析

3 讨论

计算机辅助DNA倍体分析在细胞病理学诊断中发挥重要作用[7-10]，DNA 倍体异常代表肿瘤细胞染色体不稳定，与肿瘤发生发展相关[4]。EGFR是一种酪氨酸激酶受体，属于ErBb 家族，EGFR基因突变与肺腺癌的发生发展及预后有着密切关联。研究肺腺癌肿瘤细胞DNA 倍体异常与EGFR突变及预后的关系可以为肺腺癌患者个体化治疗提供重要预测信息。

随着人工智能的发展，越来越多的研究者发现基于病理图像可以预测肿瘤相关指标，包括基因突变、分子亚型、治疗效果等[11-13]。王荃等[14]的研究结果显示非小细胞肺癌的病理图像可以预测EGFR基因突变。DNA倍体分析作为一种低级别人工智能，本研究探索了基于DNA 倍体异常预测EGFR基因突变的可能性。有研究表明DNA 异倍体与EGFR基因突变状态有关，EGFR突变患者DNA 异倍体比例较野生型患者更高[15]。在本研究中，在大于5c细胞的百分比、大于9c细胞的数目、最大DI 值、大于5c 细胞的平均DI 值不同组别中，高值组的患者EGFR突变率高于低值组的患者，与文献[15]报道结果一致。与EGFR野生型患者相比，EGFR突变型的大于5c 细胞的百分比、大于9c细胞的数目、最大DI 值、大于5c 细胞的平均DI 值和非整倍体细胞峰数的平均秩次更高。在EGFR不同突变组间，21号外显子突变的大于9c细胞的数目平均秩次高于其他突变组，而在其他DNA 倍体异常指标中EGFR不同突变组间无明显差异。EGFR突变与各DNA倍体异常指标均存在较弱的正相关关联。这表明DNA倍体异常与EGFR基因突变有着一定的相关性，在一定程度上可以用来预测EGFR基因突变。

在一项有关96例I～IIIA期手术切除NSCLC患者的研究中[16]，在单因素分析中大于5c 细胞的百分比＜5%患者较大于5c 细胞的百分比≥5%患者有更高的OS，而在多因素分析后结果表明大于5c细胞的百分比并不能作为一个独立预后因素。单因素分析结果与本研究中的结果相反，可能与患者的临床分期和大于5c细胞的百分比分界值不同有关，而多因素分析结果与本研究结果一致。在本研究中，单因素生存分析结果显示，大于5c细胞的百分比≥14%、大于9c细胞的数目≥8的患者预后好于大于5c细胞的百分比＜14%、大于9c 细胞的数目＜8 的患者，EGFR突变型患者预后好于EGFR野生型患者。但多因素生存分析结果显示，DNA倍体异常与晚期肺腺癌患者OS无关，EGFR基因突变组OS 的HR=0.576(95% CI 为0.465～0.714，P＜0.05)，这表明EGFR基因突变是肺腺癌患者的独立预后因素，而DNA倍体异常并不是肺腺癌患者的独立预后因素。DNA倍体异常与预后的关系在单因素和多因素分析中结果不同，这可能是因为DNA 倍体异常与EGFR基因突变关联密切有关，DNA 倍体异常作为一个混杂因素在多因素生存分析中被剔除。

一项荟萃分析[17]表明，在肺癌手术患者中，与EGFR野生型患者相比，EGFR突变患者OS 更长。此外，一项关于5780例早期非鳞状NSCLC 患者的回顾性研究[18]发现EGFR突变患者的无复发生存期和OS 比野生型患者均显著延长。这与本研究结论相符，在本研究中，晚期肺腺癌患者EGFR突变组的OS优于非突变组。而许丽莉等[19]的研究结果显示在早期肺腺癌患者中，EGFR突变状态与患者术后无病生存期及OS无显著相关性，不是影响患者预后的独立因素，但相比EGFR外显子21 L858R 突变患者，EGFR外显子19 缺失患者的术后复发风险更高。Ito等[20]的一项多中心回顾性分析发现在病理分期IA～IB 期的高度恶性亚型和病理分期ⅡA～ⅢA期病例中，单因素和多变量分析显示EGFR突变患者的5年无复发生存率低于EGFR野生型患者。EGFR突变状态在肺癌患者中的预后影响存在明显争议，可能是由于肺癌患者的分期及组织学亚型不同，或者患者携带有其他驱动基因突变，这些因素均会影响研究结果。

本研究中年龄和吸烟史与晚期肺腺癌患者预后有关，年龄＜62 岁患者预后好于年龄≥62 岁的患者；无吸烟患者预后好于吸烟患者，与文献[21]报道相符。但本文仅随访了患者OS，并未统计患者的无进展生存时间，可能会使结果存在一定的局限性，后续研究中我们将进一步扩大样本量，延长随访时间，增加患者无进展生存时间指标，进一步分析DNA 倍体异常与EGFR基因突变对患者预后的影响。

晚期肺腺癌患者常常较难获得组织学标本，本研究采用胸水细胞学标本进行DNA 倍体异常与EGFR突变检测，将DNA 倍体异常与EGFR突变进行相关性分析，并用COX单因素和多因素生存模型分析两者与预后的关系，为晚期肺腺癌患者的预后及精准治疗提供了依据。

总而言之，晚期肺腺癌患者中EGFR基因突变与DNA 倍体异常存在关联，DNA 倍体异常是预测EGFR基因突变的潜在指标。DNA倍体异常不是晚期肺腺癌患者的独立预后影响因素，而EGFR基因突变患者预后好于野生型患者，可作为晚期肺腺癌患者预后的预测因子。