基于物质基础与颜色变化相关性分析的制何首乌古今炮制方法探讨

于 淼，代 悦，刘涛涛，肖永庆，李 丽

中国中医科学院 中药研究所，北京 100700

何首乌为蓼科何首乌属植物何首乌Polygonum multiflorumThunb.的干燥块根，味苦、甘、涩，性微温。生品具有解毒、消痈、截疟、润肠通便等功效，炮制后味转甘厚而性转温，增强了补肝肾、益精血、乌须发、强筋骨、化浊降脂等功效[1]，故临床多以制品应用[2]。近年来有关何首乌不良反应事件频发[2-4]，其中以肝毒性为主，由此引发了对何首乌临床安全用药的广泛关注。《中国药典》2020 年版收载的制何首乌炮制方法中对于炮制终点的规定仍采用性状描述，即“炖至汁液吸尽；或蒸至内外均呈棕褐色”，缺少客观化的评判标准，易造成饮片炮制程度不一，品质参差不齐等问题，可能成为影响临床疗效并引发临床不良反应的重要因素之一[5]。本课题组对何首乌古今炮制方法进行了梳理，发现九蒸九晒是古代何首乌的经典炮制方法，始载于宋代《太平圣惠方》[6]，并作为主流炮制方法沿用至清代，其中《本草纲目》记载的“用何首乌赤白各一斤，竹刀刮去粗皮，米泔浸一夜，切片，用黑豆三斗，每次用三升三合三勺，以水泡过，砂锅内铺豆一层，首乌一层，重重铺尽，蒸之，豆熟，取出去豆，将何首乌晒干，再以豆蒸，如此九蒸九晒，乃用”[7]，应用较为广泛，后因炮制方法繁琐，无法满足现代化工业生产的需求而逐渐被无需反复蒸晒的现代炮制方法取代。但古籍记载何首乌炮制时曾有“（何首乌）制非九次，勿寝其毒”之说[8]，提示反复炮制减毒作用更强。同时，现代研究也表明，九蒸九晒法对何首乌减毒效果最好，与药典法炮制的何首乌相比，对肝细胞生长的抑制率更低、损伤更小[9-10]。因此，九蒸九晒炮制方法不仅具有其合理性，也为解决何首乌临床用药安全性问题提供了新的途径。

目前，部分学者对九蒸九晒制首乌饮片进行了相关研究，采用谱学技术对其化学成分进行定性定量分析，并对其进行了肝毒性评价[11-12]，但现有研究中记载的九蒸九晒方法多受现代方法影响，采用液体辅料（黑豆汁）蒸/炖的方式，而非古代文献记载的固体辅料（黑豆）蒸/炖[7]，其炮制方法的复原有一定偏差性。同时，现有研究多注重于对饮片内在物质的分析，而忽略了传统性状在其工艺制订和质量评价中的作用。颜色作为中药饮片最直观的性状特征，不仅是其质量评价的重要指标之一，也是炮制工艺重点控制的主要参数[13-14]。何首乌饮片经炮制后颜色加深，主观描述难以准确反映其颜色变化，电子眼作为一种基于模拟人体感官而出现的人工智能感官技术，可以客观表征饮片颜色，尤其能准确区分不同炮制方法饮片间的微小色差，兼具图像采集、数字图像处理和结果反馈功能[15]，目前已广泛应用于中药饮片的颜色测定与质量评价[16-18]。为了追本溯源，本实验将遵循古代文献记载方法制备九蒸九晒制何首乌饮片，与《中国药典》2020 年版收载的炮制方法进行比较，通过主要化学成分的定量分析、基于智能感官分析技术的颜色客观表征，以及二者的相关性分析，探讨制何首乌古今炮制方法的差异性。为进一步规范何首乌饮片炮制工艺，稳定制何首乌饮片质量，提高其临床应用安全性奠定基础。

1 材料

LC-20AT 型高效液相色谱仪，日本岛津公司；VA400 型IRIS 视觉分析仪，含CMOS 镜头、颜色校准板与Alpha Soft 14.3 数据分析软件，法国Alpha M.O.S 公司；FA2204B 型电子天平，万分之一，上海精密科学仪器有限公司；XSR105DU 型电子分析天平，十万分之一，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；ZN-08L 小型高速粉碎机，中科耐驰技术（北京）有限公司；KQ-100DE 型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；DK-98-IIA 型电热恒温水浴锅，天津市泰斯特仪器有限公司。

何首乌药材购自四川宜宾，黑豆药材购自甘肃，经中国中医科学院中药研究所肖永庆研究员鉴定为蓼科何首乌属植物何首乌P.multiflorumThunb.的干燥块根和豆科大豆属植物大豆Glycinemax(L.)Merr.的干燥成熟种子；何首乌委托河北百草康神药业有限公司按照《中国药典》2020 年版何首乌项下方法加工为生品（标记为HSW）。

对照品没食子酸（批号wkq21090111）、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷（批号wkq21060404），质量分数均≥98%，四川省维克奇生物科技有限公司；对照品5-羟甲基糠醛（批号20090201）、2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷（以下简称二苯乙烯苷，批号19070305）、大黄素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷（批号20120702），质量分数均≥98%，成都普菲德生物技术有限公司；对照品大黄素，批号D- 029-190713，质量分数≥98%，北京融城鑫德科技发展有限公司；对照品大黄素甲醚，批号PS0291- 0020，质量分数＞98.5%，成都普思生物科技股份有限公司；乙腈为色谱纯；水为纯净水；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 何首乌不同饮片的制备

2.1.1 九蒸九晒何首乌饮片 取黑豆10.8 kg，加1.2倍水浸泡12 h。取生何首乌饮片约3.6 kg，拌入泡黑豆的水闷润至水被吸尽，与浸泡后的黑豆间隔铺放至炖制容器中，炖制4 h（电磁炉1800 W、圆气计时），弃去黑豆，取出何首乌饮片，平铺摊开晾干，作为一蒸一晒何首乌饮片，再加入新的黑豆（浸泡12 h）重复上述操作，反复9 次，得到九蒸九晒何首乌饮片。平行制备3 份（标记为ZSSW9-1～3）。

2.1.2 药典法制何首乌饮片 参照《中国药典》2020年版一部制何首乌项下黑豆汁炖法制备，取生何首乌饮片约1 kg，加黑豆汁拌匀，炖至汁液吸尽，取出，自然晾晒至干燥后，得到药典法制何首乌饮片。平行制备3 份（标记为ZSW-1～3）。

黑豆汁制法：取黑豆300 g，加水适量，煮约4 h，熬汁约450 g，豆渣再加水煮约3 h，熬汁约300 g，合并得黑豆汁约750 g。

2.2 何首乌不同饮片中7 个成分的含量测定

2.2.1 色谱条件 Agilent Zorbax SB-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为乙腈-0.1%甲酸水溶液，梯度洗脱：0～20 min，5%～25%乙腈；20～26 min，25%～35%乙腈；26～30 min，35%～50%乙腈；30～35 min，50%～70%乙腈；35～45 min，70%～90%乙腈；45～50 min，90%乙腈；检测波长280 nm；体积流量1.00 mL/min；柱温30 ℃；进样量10 μL。此条件下所测各成分能够较好分离，色谱图见图1。

图1 混合对照品 (A) 与何首乌供试品 (B) 的HPLC 图Fig. 1 HPLC of standards and test samples of Polygoni Multiflori Radix

2.2.2 对照品溶液的制备 精密称定没食子酸、5-羟甲基糠醛、二苯乙烯苷、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黄素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黄素、大黄素甲醚对照品各适量，分别加80%甲醇制成质量浓度分别为57.6、68.4、625.0、50.2、8.6、180.0、0.216 μg/mL 的对照品溶液，即得。

2.2.3 供试品溶液的制备 取何首乌饮片粉末（过40 目筛）约1 g，精密称定，置平底烧瓶中，精密加入80%甲醇25 mL，密塞，称定质量，加热回流提取30 min，放冷，密塞，再称定质量，用80%甲醇补足减失的质量，摇匀，经微孔滤膜（0.45 μm）滤过，即得。

2.2.4 线性关系考察 分别精密吸取对照品溶液1、5、10、15、20、25 μL，注入液相色谱仪，按“2.2.1”项下色谱条件测定，以对照品质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）绘制标准曲线，并计算得到回归方程与线性范围，结果分别为没食子酸Y＝28 655.693 5X－3 449.895 2，R2＝1.000 0，线性范围5.76～144.00 mg/L；5-羟甲基糠醛Y＝78 294.955 3X＋11 679.404 8，R2＝1.000 0，线性范围6.84～171.00 mg/L；二苯乙烯苷Y＝16 640.258 1X＋12 599.471 0，R2＝0.999 9，线性范围62.50～1 562.50 mg/L；大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷Y＝30 743.247 5X－9 558.630 6，R2＝0.999 9，线性范围5.02～125.50 mg/L；大黄素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷Y＝27 693.578 4X－241.880 6，R2＝1.000 0，线性范围0.86～21.50 mg/L；大黄素Y＝34 965.433 1X－22 341.082 3，R2＝0.999 9，线性范围18.00～450.00 mg/L；大黄素甲醚Y＝37 991.286 3X＋8 456.727 4，R2＝1.000 0，线性范围21.60～540.00 mg/L；结果表明，各对照品在各自范围内线性关系良好。

2.2.5 精密度试验 精密吸取供试品溶液（ZSW-1）10 μL，重复进样6 次，按“2.2.1”项下色谱条件测定，6 次测定结果显示，没食子酸、5-羟甲基糠醛、二苯乙烯苷、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黄素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黄素、大黄素甲醚峰面积的RSD 分别为0.17%、0.39%、0.31%、0.54%、1.64%、0.21%、0.63%，表明仪器精密度良好。

2.2.6 稳定性试验 精密吸取供试品溶液（ZSW-1）10 μL，分别于制备后0、2、4、8、12、24 h 进样共6 次，按“2.2.1”项下色谱条件测定，结果没食子酸、5-羟甲基糠醛、二苯乙烯苷、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黄素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黄素、大黄素甲醚峰面积的RSD 分别为0.52%、0.82%、0.36%、1.38%、1.54%、0.39%、0.90%，表明供试品溶液在24 h 内保持稳定。

2.2.7 重复性试验 取制何首乌粉末（ZSW-1）约1 g，精密称定，共6 份，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，分别精密吸取10 μL，注入液相色谱仪，按“2.2.1”项下色谱条件测定，记录峰面积并计算各成分含量，结果没食子酸、5-羟甲基糠醛、二苯乙烯苷、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黄素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黄素、大黄素甲醚含量的RSD 分别为0.33%、0.92%、0.08%、1.65%、1.67%、1.59%、1.90%，表明该方法重复性良好。

2.2.8 加样回收率试验 精密称定已测定指标成分含量的何首乌粉末（ZSW-1）约0.5 g，共6 份，置平底烧瓶中，分别加入对照品适量，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液。精密吸取上述样品与对照品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，按“2.2.1”项下色谱条件进行测定，记录峰面积并计算加样回收率，没食子酸、5-羟甲基糠醛、二苯乙烯苷、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黄素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黄素、大黄素甲醚的平均加样回收率分别为98.88%、97.99%、97.32%、102.85%、108.12%、96.67%、99.33%，RSD 分别为0.36%、0.74%、0.33%、0.74%、0.93%、0.43%、1.16%，均符合《中国药典》2020 年版规定标准。

2.2.9 样品测定 分别称取生何首乌、九蒸九晒何首乌、药典法制何首乌饮片适量，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，每个样品平行2 次，按“2.2.1”项下色谱条件进行测定，记录峰面积并计算各成分含量，结果见表1。含量测定结果表明，何首乌不同饮片中均含有没食子酸、二苯乙烯苷、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黄素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黄素、大黄素甲醚6 种成分，但不同饮片间各成分含量存在一定差异。九蒸九晒、药典法制何首乌中没食子酸及蒽醌苷元类成分的含量与生何首乌相比，均有不同程度的增加，其中以没食子酸含量增加最为显著，药典法制何首乌约为生品的3 倍，九蒸九晒何首乌约为生品的2 倍。炮制为制何首乌后，苷类（二苯乙烯苷、蒽醌苷）成分含量显著减少，与生何首乌相比，九蒸九晒何首乌中二苯乙烯苷含量减少了约44%，蒽醌苷类成分含量减少了约41%；药典法制何首乌中二苯乙烯苷含量减少了约69%，蒽醌苷类成分含量减少了约85%；而5-羟甲基糠醛仅在药典法制何首乌饮片中检出，平均质量分数为0.506 1 mg/g。

表1 何首乌不同饮片主要成分含量 (n = 2)Table 1 Content of main components in different decoction pieces of Polygoni Multiflori Radix (n = 2)

2.3 基于电子眼技术的颜色分析

电子眼采用的色彩系统中L*代表明度指数，a*（红-绿轴）、b*（黄-蓝轴）代表颜色对立维度。对于样品1、2，ΔL*＝L1*－L2*，为正值时样品1 颜色偏浅，为负值时样品1 颜色偏深。Δa*＝a1*－a2*，为正值时样品1 颜色偏红，为负值时样品1 颜色偏绿。Δb*＝b1*－b2*，为正值时样品1 颜色偏黄，为负值时样品1 颜色偏蓝。样品颜色可用色度值（Eab*）表示，计算公式为Eab*＝(L*2＋a*2＋b*2)1/2。2 个样品之间的色差为ΔEab，计算公式为ΔEab＝(ΔL*2＋Δa*2＋Δb*2)1/2，色差值与人眼感觉色差程度的关系见表2。

表2 色差值与感觉色差程度Table 2 Color difference value and perceived color difference degree

2.3.1 视觉分析仪参数设置及供试品前处理 开启IRIS 视觉分析仪，预热15 min，待指示灯显示绿灯后，校准仪器镜头的曝光度和焦距，使用24 色色彩校正板对仪器进行校准。校准完成后设置照明模式为顶部及底部照明，拍照模式为单一快照。取适量何首乌供试品粉末（过40 目筛）于扁形称量瓶中，压平，置于仪器测量白板上，变换位置，平行拍照3 次，记录样品粉末色号及比例，计算样品色度空间参数L*、a*、b*值、样品色度值（Eab*值）及各样品间的ΔEab值。

2.3.2 何首乌不同饮片颜色比较 观察各样品颜色，可见何首乌不同饮片颜色差异明显，结果见图2。何首乌不同饮片样品色度值比较见表3。经电子眼测定，九蒸九晒何首乌与生何首乌的ΔEab＞6.0，颜色色差感觉很明显，两者ΔL*为负，Δa*为正，Δb*为负；药典法制何首乌与生何首乌的ΔEab＞6.0，颜色色差感觉很明显，两者ΔL*为负，Δa*为正，Δb*为负，说明经九蒸九晒及药典法炮制后何首乌饮片颜色均变深变红变蓝；药典法制何首乌与九蒸九晒何首乌的ΔL*为负，Δa*为正，Δb*为负，说明药典法制何首乌饮片较九蒸九晒何首乌饮片颜色变化程度更深。

图2 何首乌不同饮片颜色Fig. 2 Color of different decoction pieces of Polygoni Multiflori Radix

表3 何首乌不同饮片色度值 (n = 3)Table 3 Chromaticity value of different decoction pieces of Polygoni Multiflori Radix (n = 3)

2.4 数据分析

2.4.1 含量测定数据分析 将何首乌不同饮片主要成分含量数据导入SIMCA 14.1 进行系统聚类分析（hierarchical cluster analysis，HCA）与无监督的主成分分析（principal component analysis，PCA），观察何首乌不同饮片间聚类与自然聚集，结果见图3、4。HCA 结果显示，何首乌不同饮片可各自聚类，当分类距离大于15 时，3 种饮片聚为2 类，生何首乌聚为一类，九蒸九晒何首乌与药典法制何首乌聚为一类。PCA 结果显示，PC1 和PC2 的贡献率分别为81.60%和17.50%，累积贡献率达99.10%，说明该数据能较好反应何首乌不同饮片的整体信息。何首乌不同饮片各自聚集，可分为3 类，生何首乌集中分布在III 象限，九蒸九晒何首乌集中分布在I 象限，药典法制何首乌集中分布在IV 象限。

图3 何首乌不同饮片主要成分含量HCAFig. 3 HCA of contents of main components in different decoction pieces of Polygoni Multiflori Radix

图4 何首乌不同饮片主要成分含量PCAFig. 4 PCA of contents of main components in different decoction pieces of Polygoni Multiflori Radix

2.4.2 电子眼测定数据分析 将何首乌不同饮片色度值数据导入SIMCA 14.1 进行HCA 与PCA，观察何首乌不同饮片间聚类与自然聚集，结果见图5、6。HCA 结果显示，何首乌不同饮片可各自聚类，当分类距离为10 时，3 种饮片聚为2 类，生何首乌聚为一类，九蒸九晒何首乌与药典法制何首乌聚为一类。PCA 结果显示，PC1 和PC2 的贡献率分别为99.60%和0.33%，累积贡献率达99.93%，说明该数据能较好反映何首乌不同饮片的整体信息。何首乌不同饮片各自聚集，可分为3 类，生何首乌集中分布在I 象限，九蒸九晒何首乌集中分布在III 象限，药典法制何首乌集中分布在II 象限。

图5 何首乌不同饮片色度值HCAFig. 5 HCA of chromaticity value in different decoction pieces of Polygoni Multiflori Radix

图6 何首乌不同饮片色度值PCAFig. 6 PCA of chromaticity value in different decoction pieces of Polygoni Multiflori Radix

2.5 何首乌不同饮片主要成分含量与颜色变化的相关性分析

普通多元线性回归建模前提必须满足样本数量较多，变量数量较少，且变量之间无多重共线性的条件才具有合理性，若数据不能完全满足上述条件，则模型无法使用。本实验中变量较多，且成分之间存在多重共线性的问题，因此无法采用普通多元线性回归模型。偏最小二乘回归（partial least squares regression，PLS）法可以提取出对因变量解释最强、影响最大的综合变量，辨识系统中的信息与噪声，因此很大程度上能够克服变量之间的多重相关性在回归建模中的不良作用，可以有效地解决在普通多元线性回归的建模过程中因自变量之间存在多重相关性而影响参数估计的准确性和合理性的问题，缩小模型误差，增强模型的稳健性[19]。

在PLS 回归模型中，R2X和R2Y分别表示模型对自变量和因变量的解释能力，Q2表示模型的预测能力，通常认为上述3 个指标以大于0.5 为宜，越接近1 表示模型拟合数据效果越好；自变量在解释因变量时作用的重要性可以用变量投影重要性指标（VIP）来度量，通常认为VIP 值大于1 的自变量对因变量有显著影响。

将测得的成分含量数据与颜色指标L*、a*、b*值导入SIMCA 14.1 软件，以成分含量作为自变量，各颜色指标作为因变量，建立PLS 模型。建立的PLS模型R2X＝0.991，R2Y＝0.988，Q2＝0.981，说明建立的模型稳定且预测能力较强。根据VIP 值＞1 的原则，可发现没食子酸、二苯乙烯苷、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黄素甲醚对何首乌的各颜色指标有显著影响，5-羟甲基糠醛、大黄素甲醚-8-O- β-D-葡萄糖苷、大黄素对何首乌颜色无显著影响。见图7。

图7 何首乌不同饮片成分与颜色PLS 分析Fig. 7 PLS analysis on composition and color of different decoction pieces of Polygoni Multiflori Radix

根据PLS 模型的回归系数（表4），没食子酸、大黄素、大黄素甲醚的含量与L*、b*值呈负相关，与a*值呈正相关；5-羟甲基糠醛的含量与L*值呈负相关，与a*、b*值呈正相关；二苯乙烯苷、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黄素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷的含量与L*、b*值呈正相关，与a*值呈负相关。提示没食子酸、大黄素、大黄素甲醚这3 种成分与何首乌饮片变深、变红、变蓝有关，与炮制后何首乌饮片颜色总体变化相一致；二苯乙烯苷、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黄素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷这3 种成分与何首乌饮片变浅、变绿、变黄有关，与炮制后何首乌饮片颜色总体变化相反。

表4 何首乌不同饮片成分-颜色标准化回归系数Table 4 Standardized regression coefficient of composition and color of different prepared slices of Polygoni Multiflori Radix

3 讨论

本实验分别采用50%、80%、100%甲醇及50%、80%、100%乙醇作为提取溶剂考察对各成分含量的影响，结果表明以80%甲醇提取各成分含量较高且峰形良好，因此选用80%甲醇作为提取溶剂；分别比较了超声15、30、45、60 min，回流30、60、90、120 min，冷浸4、8、12 h 对各成分含量的影响，结果表明回流对各成分的提取率较高，且不同回流时间下提取率差异不大，因此选用回流30 min 作为提取方法。通过对提取方法的考察，最终确定本实验供试品溶液的制备方法为80%甲醇回流提取30 min。本实验通过对古代经典九蒸九晒炮制法与药典法制何首乌饮片的对比研究，发现二者主要成分含量及颜色的总体变化趋势较为相似，但有程度上的差异，且二者成分组成也有明显的区别。

何首乌中含有鞣质类成分和具有没食子酰基的苷类成分[20-21]，在炮制过程中上述成分受热分解后转化为没食子酸[22-23]，故炮制后没食子酸量显著增加。二苯乙烯和蒽醌类成分是何首乌中的主要有效成分，同时也是其肝毒性的主要物质基础[24-25]，二者的含量及结构与何首乌肝损伤的发生密切相关，可通过控制合理的炮制工艺，将上述2 类成分的含量控制在安全有效的范围内，以便提高用药的安全性[26]。二苯乙烯及蒽醌类成分对光、热具有不稳定性[27-28]，在加热炮制过程中会发生分解，在反复蒸、晒过程中会发生光环加成反应[29]，因此，采用连续加热方式的药典法制何首乌比采用间隔蒸、晒方式的九蒸九晒何首乌中上述2 类成分含量降低的幅度更为显著。

5-羟甲基糠醛既是Maillard 反应产物，又可通过糖的直接降解或脱水产生[30-31]，温度的升高和加热时间的延长均可导致其含量增加[32]，因此5-羟甲基糠醛成为很多采用加热炮制（炒制、蒸制、炖制等）中药饮片的特征性标志物。何首乌中含有的糖类成分以及炮制过程中苷类分解产生的糖类成分均可与氨基成分发生Maillard 反应，从而生成5-羟甲基糠醛。本实验中仅在药典法制何首乌饮片中检测到了5-羟甲基糠醛，而九蒸九晒何首乌饮片中未检出该成分，说明5-羟甲基糠醛的产生与炮制工艺密切相关。药典法采用液体辅料连续炖制，而九蒸九晒法采用固体辅料间隔蒸、晒，何首乌饮片在两种方法炮制过程中的受热程度、加热方式、加热时间及光照等都有着显著差异，且5-羟甲基糠醛性质活泼，对温度、湿度、光、空气较为敏感[33]，可进一步分解为乙酰丙酸和甲酸或是聚合[34]，推测在九蒸九晒何首乌中由于“晒”这一工艺环节，导致已生成的5-羟甲基糠醛分解，因此未能检出。

5-羟甲基糠醛具有抗心肌缺血、抗氧化等作用，同时，该成分还易导致结肠小囊异常生长（aberrant crypt foci，ACF），对人体横纹肌和内脏也具有毒副作用[34]。此外，不同炮制方法对何首乌饮片中主要成分的量比关系也有显著的影响，九蒸九晒制何首乌中各类成分的量比关系约为没食子酸-二苯乙烯苷-蒽醌苷-蒽醌苷元（1∶25∶2∶10），而药典法制何首乌中上述成分的量比关系约为1∶11∶0.3∶7，各成分间量比关系差异显著，因此，古今2 种方法制备的何首乌饮片主要药效物质组成及量比关系的显著差异极有可能会成为导致其药效及毒性差异的主要原因，后续将通过相关药效学实验进行系统的研究。

电子眼测定结果表明，不同炮制方法对何首乌饮片颜色的影响也不尽相同。颜色的变化主要源于2 个方面，一方面是何首乌在炮制过程中自身化学成分在高温、高湿的条件下发生褐变反应，生成褐色聚合物，导致饮片颜色加深；另一方面是源于炮制过程中辅料的间接影响，药典法应用的液体辅料黑豆汁中含有大量色素类成分[35]，对何首乌饮片起赋色作用，导致其饮片颜色加深，而九蒸九晒方法中应用的是固体辅料黑豆，对何首乌饮片几乎无赋色作用，由此形成了两种方法炮制的何首乌饮片颜色上的差异。

为了进一步分析何首乌饮片物质基础与颜色的相关性，本实验对测定的7 种主要化学成分含量与颜色特征值进行了多元统计分析，HCA 和PCA 结果显示古今方法炮制的何首乌饮片可各自聚为一类，且与生何首乌相比，古、今方法炮制的何首乌饮片可聚为一类，进一步验证了九蒸九晒法与药典法制何首乌饮片的个性特征及共性规律。没食子酸及蒽醌苷元含量与何首乌饮片颜色变深呈正相关，二苯乙烯苷及蒽醌苷含量与何首乌饮片颜色变深呈负相关。因此，可通过快速无损的颜色检测，实现对何首乌饮片炮制工艺的控制及饮片质量的客观评价。本实验从物质基础与颜色变化的相关性角度对古代经典九蒸九晒炮制方法与现代药典收载的制何首乌炮制方法进行了对比研究，结果显示，2 种方法炮制的制何首乌饮片虽然在外观性状的主观评价上具有较高的相似性，但通过现代智能感官分析技术的客观表征和主要药效物质的分析，可以初步证明古今2 种方法炮制的制何首乌饮片是2 种独立的药效载体，传统经典炮制方法存在的合理性不仅有其悠久临床应用历史的佐证，也有现代科学技术对其科学内涵的阐释，二者不具有替代性。进一步系统开展2 种炮制方法的药效学研究，将为全面分析何首乌古今炮制方法，解决何首乌炮制工艺不规范、质量不稳定等问题，提高何首乌临床应用的安全性和有效性提供新的依据。

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