液滴微流控-表面增强拉曼检测新技术及应用

张奇 王玉峰，2 齐小花 薛强 邹明强*

（1.中国检验检疫科学研究院& 国家药监局体外快速诊断试剂技术转化与控制重点实验室 北京 100123；2.南京农业大学动物医学院）

0 引言

液滴微流控和表面增强拉曼光谱（SERS）技术作为近年来分析化学领域的两大研究热点，正在引起广泛关注和持续的研究兴趣。 液滴微流控是利用微流体控制技术，在微通道中精确生成、操控和合并微小液滴，为实现高效、灵活和可控的微尺度流体操作提供了一种平台[1]。 SERS 技术则通过将分析物吸附到金属纳米结构表面以显著增强其拉曼检测信号，具有特异性、快速、灵敏检测等特点，为化学物质结构分析和定量检测提供了无可比拟的手段[2]。

目前，SERS 检测在化学分析和生物医学领域具有广泛应用[3]，但也存在着一些问题需要解决：（1）检测重复性方面：由于制备纳米结构、样品制备和分析条件的差异， 不同实验室的SERS 结果可能存在较大差异，导致重复性问题。 （2）检测灵敏度方面：SERS技术易受样品基质干扰， 即易受背景信号和噪声影响，导致特征SERS 信号低，即检测灵敏度低。 此外，传统SERS 对于样品体积要求较大， 限制了其在微量分析中的应用。液滴微流控技术的出现，以其独特的优势改变了传统微流控技术或者传统分析方法所遇到的一系列限制， 可实现微小尺度的反应控制和分析操作，为非破坏性、非接触式的拉曼检测提供了精准可控、灵活、高通量的辅助分析平台，对于微量样品的处理和分析具有明显的优势[4]。

基于液滴微流控技术的SERS 检测具有以下优势：（1）避免液体蒸发和记忆效应：液滴微流控系统可以防止液体蒸发， 并避免连续微流控中样品在通道壁上的长期停留，从而降低了记忆效应的影响[5]。（2）提高分析物扩散和浓缩效率：通过电动力浓缩、磁性捕获、流体动力聚焦或介电泳等手段[6-7]，液滴微流控系统可以改善分析物向增强基底的扩散效率，提高了分析灵敏度。（3）高通量和高效率分析：液滴微流控系统能够生成和操纵大量的离散液滴，实现高通量分析和高效率反应过程， 从而提高了分析速度和效率。 （4）提高重复性和稳定性：通过精确控制液滴的大小和分离， 液滴微流控系统能够实现对实验条件的高度稳定控制， 从而提高拉曼分析重复性和稳定性。 通过液滴微流控-SERS 技术，可以实现对微生物的单细胞分析、 药物筛选和分子检测等方面的研究，为生命科学、化学分析和医学诊断等领域提供了广阔的应用前景[8-9]。

本文通过液滴微流控技术简介， 分析其与SERS 技术结合的几种应用并展望二者结合所面临的挑战和未来应用领域。 文中介绍了目前多种微流控平台通道制作和液滴生成方法， 展示了两种技术结合在化学反应过程原位分析、 单细胞分析和拉曼活性颗粒可控合成领域中应用。 探讨了两种技术结合在灵敏度、 重复性和快速检测应用等方面所面临的挑战，并展望了液滴微流控-SERS 技术未来发展趋势和潜在应用前景。

1 微流控平台的构建与液滴的生产

1.1 微流控通道制作技术

液滴微流控平台的SERS 检测性能和效果与微流控通道设计与制作具有密切关系， 后者是液滴微流控的首要和基本的关键步骤。 为了实现液滴的产生、操作和进一步实现特定功能，微通道制作与设计须具有高集成度、特定几何结构和物理化学特征，尤其是表面性质。 目前， 微流控芯片制作主要采用玻璃/硅基微加工[10-11]、聚合物复制成型[12]、商用模块化组装[13]及3D 打印[14]等技术和方法。 不同方法在微流控芯片制造中液滴生产过程中具有如下的优缺点：玻璃/硅基微加工芯片具有优秀的化学和热学稳定性，能够实现高精度的微加工，适用于制作复杂的微通道结构； 然而造价较高， 对设备和工艺要求较苛刻，难以实现大规模、低成本生产。 聚合物复制成型方法造价相对较低，适合批量生产，可实现快速复制微通道结构；其缺点是材料稳定性较差，可能存在材料溶解或化学反应问题且不适用于高温或腐蚀性液体条件的应用场景。商用模块化组装方法，可快速构建微流控芯片，适用于原型和小规模生产；然而模块化组装的灵活性有限， 难以实现定制化设计并存在接口可靠性和泄漏问题。3D 打印法具有高度设计自由度，可构建复杂的微通道结构，快速、灵活，适用于快速原型制造；只不过该技术目前仍在发展中，打印精度指标和可供选择的材料均有限， 打印速度较慢且不适用于规模化生产。

1.2 液滴生成与操作方法

液滴的生成和操作是液滴微流控平台的核心环节。 液滴生成方法包括被动液滴生成法和主动液滴生成法。其中，被动液滴生成法是指在液滴生成期间仅存在流体的压力作用，无其它外部能量的输入。目前水动力法是被动液滴生成法中主流方法， 主要有T 型通道法、流动聚焦法和毛细管共轴流聚焦法。通过压力作为驱动， 利用流动相改变分散相液体流动状态，使其分割成无数个离散均一液滴。主动控制法是通过在液滴生成过程中引入机械、磁、光、热和电等[15-17]外部能量来控制微流体的表面能，从而精准控制液滴的生成。液滴的操控主要包括液滴合并、分离和混合等。通过控制外部力场、调节流速或改变流体界面的性质，液滴的位置、大小和形状可被精确操控。例如，利用电场、磁、声波或加热等外部力场可实现液滴的合并和分离操作[4]。 此外，通过选择适当的表面活性剂添加改变液滴的表面性质， 可实现液滴内部的混合和分离过程，促进化学反应、生物分析或制备复合材料等应用。

2 液滴微流控-SERS 技术的应用

2.1 化学反应的原位表征

原位表征在化学反应理解和优化中具有重要性，能够揭示反应过程中物质结构变化、动力学行为和催化机制[18-19]。 微流控液滴可作为独立的反应容器，这在化学反应在线监测中具有很大吸引力，因为这具有可精确控制反应试剂，快速优化反应条件，且不受外部环境的影响等优点[20]。 例如，传统的Fenton反应中SERS 监测通常会面临一些问题： 催化剂Fe2+的不断损失以及Fe3+水解引起的固体污泥的形成不利于反应的连续性， 且Fe2+引起的SERS 底物聚集不利于连续SERS 监测[21]。 为此，YUE 等[22]首次将芯片上微液滴系统应用于实现染料的Fenton 降解过程在线SERS 监测。Fenton 试剂、罗丹明B 染料和SERS 基底分别引入到微流控芯片中， 在汇聚后形成微液滴， 避免了Fe2+催化剂的损失和SERS 基底的聚集，确保了相对稳定的化学反应环境，从而实现染料Fenton 降解的连续监测。 该方法直接揭示了罗丹明染料的降解机制， 表明呫吨和羧基苯之间的化学键在反应过程中不断断裂。此外，液滴的高界面面积有利于研究皮克林乳液催化过程。 传统批量皮克林乳液是通过剧烈搅拌制备的， 因此显示出较宽的液滴尺寸分布， 难以测量动力学和两相之间的低界面面积等[23]。 该过程中皮克林乳液的不透明性和紧密相混合使其在线研究变得困难，需要取样、破乳才能进一步分析。 VIS 等[24]首次利用液滴微流控-SERS 实现对皮克林乳液催化的在线原位研究，由于液滴的高界面面积， 该方法使酸催化脱缩醛反应产率提高了9 倍。 通过皮克林乳液的高稳定性限制酸和碱催化剂的相互破坏， 改善了拮抗脱缩醛-Knoevenagel 缩合串联反应的性能，为进一步研究皮克林乳液催化过程提供了通用方法。 这些工作凸显了液滴微流控-SERS 在监测特殊反应的独特性和潜力，尤其在减少外界环境干扰排除记忆效应，增大界面效应和连续动态监测等方面， 为原位化学反应研究带来了重要的意义和广阔的应用前景。

2.2 单细胞的分析

单细胞分析在揭示个体细胞的异质性、深入理解细胞功能、发育和疾病机理方面具有重要作用，同时为个性化医学提供了基础。 液滴微流控与SERS 技术的结合在单细胞分析上有着广泛的应用前景[25]。从实验室规模到临床应用， 微流体系统中细胞和液滴的分类对研究人员非常有用。 相比于常见的荧光激活细胞分选和磁激活细胞分选技术， 拉曼激活细胞分选技术能够以无标记和非侵入的方式从同基因群体或复杂的细胞群落中识别和分离目标类型、状态或环境的单个细胞[26-27]，然而通量仍然是限制其更广泛应用的主要因素之一。 WANG 等[28]通过将细胞封装在尺寸相当的微滴中， 实现了对不同含量虾青素的红球藻活细胞进行无标记和高通量筛选，细胞分选率达98.3%，处理量约为260 细胞/分钟且分选后的细胞92.7%仍然能够存活并成功增殖。 同时液滴微流控-SERS 技术也被用于单细胞的分子分析中。WILLNER 等[29]通过在微滴中包封单个细胞和小麦胚芽凝集素功能化的SERS 探针， 检测细胞表面分子的表达， 从而实现对肿瘤学靶点开展研究和进行细胞间异质性观察。此外，微滴为单细胞提供了生存空间， 可以在其中积累和分析细胞分泌的代谢物。通过巧妙的反应设计和免疫夹心系统，可以实现对单细胞代谢物的高灵敏检测， 并同时分析多种代谢物，进而揭示细胞的功能状态和代谢特征[30]。液滴微流控-SERS 技术在单细胞测序方面也具有重要意义[31]。通过精确封装目标细胞在微滴中，并在后续测序中精确导出， 可实现从单个细胞获得完整基因组序列分析。 这种方法可用于分离和鉴定具有临床意义的细胞，例如耐药性细菌，并具有高基因组覆盖率和高分辨率优势。 因此，液滴微流控-SERS 技术为单细胞分析提供了一种高通量、 高灵敏度和非侵入性的监测手段，在研究细胞异质性、探索细胞功能和代谢特征等方面具有重要意义， 并展示了广阔的应用前景。

2.3 SERS 活性颗粒可控合成用于小分子的检测

结构可控的SERS 活性颗粒对于拉曼检测重复性尤为重要， 然而可控制备出均一性好的SERS 活性颗粒具有挑战性。 液滴微流控系统制备的SERS活性微粒具有可控的均匀尺寸和形态[32]，主要包括聚合物基质微粒和光子晶体微粒。 WANG 等[33]结合自上而下（微滴产生和金属薄膜沉积） 和自下而上（纳米颗粒自组装）工艺优点，提出一种快速可靠的生成等离子体微传感器的方法。 通过微流控技术进行高频率和连续的液滴生成、 空间限域二氧化硅纳米颗粒的自组装来控制微球体积分数和填充密度以及物理薄膜沉积在微球表面以精确形成等离子体纳米结构，成功制备了具有>107平均增强因子的高质量SERS 活性基底，且具有良好的重现性。基于液滴微流控制备的微粒还具有尺寸选择性、pH 敏感性[34]和温度响应性[35]等良好特性，由此展现出对生物小分子良好的SERS 检测能力。 例如对于生物体液中小分子检测，蛋白质往往会吸附在金属表面，形成蛋白质电晕现象，从而显著降低SERS 散射强度。为解决这个问题，KIM 等[36]通过将金和立方银纳米结构封装在聚乙二醇二丙烯酸酯微球中， 制备出具有尺寸排阻效应的SERS 微球。 通过调节聚乙二醇二丙烯酸酯单体浓度，成功消除了蛋白质电晕效应。这种新型微凝胶可直接用于生物液体中待测物SERS 检测，无需进行任何预处理，带电基质微凝胶通过静电引力可浓缩带有相反电荷的小分子[37]。 所制备的含有金纳米颗粒双乳液微凝胶可使拉曼信号提高2 个数量级[38]，极大提升了小分子检测灵敏度，提供了一种高效、准确的生物体液中小分子检测方法。 因此，基于液滴微流控系统制备的SERS 活性微粒可有效提高拉曼检测灵敏度和重复性， 并通过灵活的结构设计可应用于复杂样品体系， 未来有望应用于健康监测、疾病诊断和药物残留检测等领域。

3 技术挑战与未来发展方向

3.1 提高拉曼检测性能的方法与策略

为了提高拉曼检测灵敏度，可通过超声、光和热等手段对液滴内待测分子进行快速无损富集和SERS 基底的空间可控聚集[35，39]，促使分子进入更多空间热点从而增强拉曼散射信号。此外，仍需深入开展液滴微流控系统中不同金属纳米结构影响机制研究，例如，微反应器中分布和聚集，形貌尺寸和胶体稳定性等[40]。 为了扩大基于液滴微流控SERS 系统的应用范围， 需要对基底制备和修饰过程进行标准化， 因为这些因素直接影响SERS 分析性能。 同时SERS 分析的选择性也值得关注，SERS 基底除了通过抗体、适配体和多肽修饰以外，还可以利用尺寸、电荷和材料提高选择性[41]。

3.2 发展快速、便携化检测设备

简化和模块化分析系统， 这包括简化分析系统以提高便携性，设计新的芯片样品前处理功能模块，以及能够在恶劣条件下进行特定反应的模块[41]。 将多相样品混合，液滴生成、混合、分割、捕获和排序等操作集成到芯片中作为前处理功能模块， 结合便携式拉曼光谱仪作为检测手段， 适合于实时场景中快速检测[42]。 通过引入磁珠、电场、温控等模块可丰富设备的功能，实现检测和应用领域的多元性。通过将人工智能和机器学习算法与液滴微流控结合， 可实现自动化检测设备操作和数据分析， 提高检测效率和准确性[43]。

3.3 其它领域快速检测应用

液滴微流控系统可将农药、 抗生素和药物残留物等小分子限域在微液滴中， 使样品与SERS 基底充分接触，增加了待测分子的聚集程度，从而增强拉曼散射信号。通过在芯片上进行高度集成，可在短时间内完成整个分析流程，包括样品预处理、微反应器的高通量生成、待测分子的富集和液滴检测，提高了分析的综合效率[44]。 此外，液滴微流控结合SERS 技术具有样品消耗量极低的优势， 减少了对食品和耗材的浪费，节约了成本。

目前，微流控-SERS 技术已成功实现了对真实食物基质中污染物的原位分析。 例如，牛奶中三聚氰胺和氨苄青霉素、 果汁中甲基对硫磷及其他复杂基质食品中重金属离子和食源性病原体等快速检测[42]。随着相关研究的不断发展，液滴微流控-SERS技术有望在食品农产品安全、临床诊断、生物医学和环境监测等领域发挥更多作用，以保障人类的健康和安全。

4 总结

液滴微流控-SERS 技术具有其独特技术优势。结合采用液滴微流控技术， 有极大潜力克服传统拉曼光谱检测重现性、灵敏度、稳定性等不足。 液滴微反应器提供了均匀稳定的微环境， 可改善拉曼检测结果的重复性和记忆效应。 微米级液滴的高界面面积和微反应器中快速混合， 大大提高了化学反应效率和SERS 检测通量。此外，液滴微流控技术还能可控制备具有独特结构的SERS 活性微粒， 进一步提升了检测重复性和灵活性。 液滴微流控-SERS 技术在化学反应过程原位监测、 单细胞分选和分子分析和体液小分子快速检测中的成功应用， 已显出其良好的技术特性。 可以预见， 基于液滴微流控-SERS技术完全能研制出更多功能模块，从而研发出快速、便携化检测设备，并应用于食品农产品安全、临床诊断、生物医学和环境监测等领域快速检测。