猪肉中三种β-受体激动剂残留物表面增强拉曼光谱检测技术研究

裴佳欢 盛万里 邹明强 齐小花*

（1.中国检验检疫科学研究院& 国家市场监管重点实验室（食品质量与安全） 北京 100176；2.北京工业大学环境与生命学部；3.呼和浩特海关技术中心）

0 引言

β-受体激动剂类物质（别名瘦肉精）是一类具有肾上腺素功能的化合物， 对动物体内营养再分配具有促进作用，可促进蛋白质合成[1]。 这类物质通常按结构可分为苯胺型、苯酚型和苯二酚型等三大类，在临床上主要用于治疗哮喘、 慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）等呼吸系统疾病， 在动物饲养中， 由于具有减少脂肪积累、促进蛋白质生成和提高饲料转化率的作用，曾被添加到动物饲料中以提高牲畜瘦肉率[2]。

常见的β-受体激动剂类物质有莱克多巴胺、沙丁胺醇、克伦特罗、西马特罗等[3]。 该类物质被错误地应用于动物养殖中，引发一系列因食用含β-受体激动剂的食物而中毒的事件， 导致人体心血管和神经系统产生严重不良反应，严重危害健康[4]。 猪肉中的瘦肉精在猪体内的使用已被大多数国家和地区（如美国、日本和欧盟）禁止。为了确保动物源性食品安全，我国农村农业部在2020 年颁布的《食品动物中禁止使用的药品及其他化合物清单》 中明令禁止使用该类药物，规定在动物源性食品中不得检出。但是，仍有一些不法商家受利益驱动，在养殖过程中违法添加。 2021 年的“央视3·15 晚会”再次曝光了某省黑心养殖户为提高出肉率， 增加利润而在饲养过程中添加“瘦肉精”的违法行为。该类事件屡次发生，引起了公众的广泛关注。因此，有必要尽快建立动物源性食品中β-受体激动剂类物质的检测方法，为食品安全检测提供技术支持。

目前，β-受体激动剂常见的检测方法有气相色谱-质谱法[5]、液相色谱-串联质谱法[6]、高效液相色谱法[7]、酶联免疫法[8]、表面增强拉曼光谱法[9]和电化学法[10]等。常用的色谱法存在一定的缺陷，如操作复杂、成本较高、前处理繁琐、实验仪器复杂等。 因此，建立一种简单高效、 灵敏度高且适用于现场快检的兽药残留方法尤为重要[11]。

表面增强拉曼光谱作为一种快速检测化学危害物的工具，能够提供丰富的目标物分子指纹图谱，并且灵敏度高， 已用于肉类中兽药残留的检测[12]。SERS 技术是指待测分子处于贵金属表面， 在电磁场和化学增强的作用下， 产生拉曼散射信号显著增强的现象[13]。 SERS 技术因其灵敏度高、简单快捷的优点， 被广泛应用于检测农兽药残留和非法添加剂等领域[14]。 从理论上讲，SERS 检测技术与其他检测方法相比具有极大优势， 特别是在复杂的环境基质中， 纳米结构SERS 衬底和便携式设备的进展将推动拉曼光谱检测技术在快速现场分析中发挥重要作用[15-18]。 本研究以胶体金溶液为SERS 基底，使用便携式拉曼光谱仪对猪肉中的克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇进行检测，建立β-受体激动剂与SERS 强度的标准曲线。

1 材料与方法

1.1 试剂与材料

氯金酸（HAuCl4，99%）、柠檬酸三钠（99.8%）（Sigma 公司）；克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇标准品（BIOFOUNT 范德（北京）生物科技有限责任公司）；甲醇、乙酸乙酯（色谱纯，北京化工厂）；盐酸、碳酸钠（分析纯， 麦克林）。 所有溶液配制使用超纯水（18.3 MΩ）。

1.2 仪器

便携式拉曼光谱仪（奥谱天成（厦门）科技有限公司）；Renishaw invia 共聚焦拉曼光谱仪（Renishaw公司）；XH-100A 微波合成萃取仪（北京祥鹄科技有限公司）；JEM-2100 透射电子显微镜（JEOL 公司）；U-3310 双光束紫外分光光度计（Hitachi Limited 公司）。

本研究采用的便携式拉曼光谱仪参数设置为激光功率500 mW，积分时间为10 s。 双光束紫外分光光度计采集胶体金的光谱范围为400～850 nm。

1.3 胶体金的合成

AuNPs 的合成如FRENS[19]所描述，利用改良的柠檬酸三钠还原法制备胶体金（AuNPs）。将1%的氯金酸溶液1 mL 加入99 mL 去离子水中，在微波合成萃取仪中加热搅拌；温度上升至98℃时，稳定温度5 min， 随后迅速加入1%柠檬酸三钠溶液1.4 mL，继续保持温度，加热搅拌5 min；颜色呈酒红色后取出，冷却至室温，存放在4℃冰箱内备用。

1.4 样品标准溶液的配制

分别称取0.01 g 的克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇的标准品于3 支10 mL 的离心管中，用甲醇溶剂[20]分别配制成1 mg/mL 的标准储备液，密闭保存备用。实验过程中，再用超纯水稀释成所需浓度使用液。

1.5 光谱采集

在采集样品光谱时，先将200 μL 的标准品水溶液和pH 值为4 浓度为1%的NaCl 水溶液混合均匀，再将800 μL 的胶体金加入到混合液中进行检测。加入NaCl 溶液可使胶体金颗粒发生聚沉。 每种β-受体激动剂选取5 个样品的不同浓度梯度进行拉曼光谱采集，每个样品采集5 次。

1.6 样品前处理

基于液-液萃取[21]方法进行，并简化步骤。 称取从市场选购的新鲜生猪肉 （不取白色脂肪组织）2.00 g 样品，充分剪碎后放入15 mL 离心管中；加入2 mL 10%的碳酸钠溶液， 将混合物涡旋混合2 min；加入2 mL 乙酸乙酯溶剂， 混合1 min； 将萃取液以10 000 r/min 离心2 min， 取上清液1 mL 于2 mL 离心管中；加入1mL 0.05mol/L 的盐酸，涡旋混合1 min；自然静置分层，弃去上层液，取下层液体为待测液，冷凝至干燥。 在使用时， 加入2 mL 超纯水重新溶解，存放于4℃冰箱内备用。

用超纯水将1 mg/mL 的标准储备液稀释成2、4、6、8、10 μg/mL 4 个不同浓度。 取200 μL 4 个不同浓度的标品溶液加入到处理后的样品中，制备含有2、4、6、8、10 μg/mL β-受体激动剂的猪肉样品，用实际添加的β-受体激动剂与猪肉质量的质量比计算制备猪肉样品中的β-受体激动剂含量。每种浓度制备3 个平行猪肉样品，并取其平均值。

2 结果与讨论

2.1 胶体金的表征

胶体金的光学性质可以用紫外/可见吸收光谱进行表征，如图1 所示，紫外可见吸收峰的出峰位置在520 nm 处。 利用峰的位置和峰宽可以估计胶体金的粒径和分散性，随着颗粒尺寸的增大，胶体金的吸收峰逐渐红移，吸收峰也越来越小[22]，尺寸和分散性随之增加。胶体金的TEM 图像如图2 所示，可见胶体金的大小和形状是均匀的，同时也具备较好的分散性。

图1 胶体金的紫外-可见吸收光谱Fig.1 UV-VIS absorption spectrum of colloidal gold

图2 Au NPs 的TEM 图像Fig.2 TEM images of Au NPs

2.2 固体β-受体激动剂SERS 光谱

当目标物被吸附或者靠近金属纳米的表面时，拉曼信号强度会明显放大[23]。3 种β-受体激动剂的标准品拉曼光谱如图3 所示，从图3 可以看出，原始光谱出现了漂移现象， 表明固体标准品粉末分散在硅片上进行检测时易受到多种因素的干扰而出现漂移现象，会对后续建立定量分析方法造成误差，故选用液相基质的检测环境，以更好地实现定性定量检测。

图3 3 种β-受体激动剂固体拉曼光谱图Fig.3 Solid Raman spectra of three beta-agonists

2.3 β-受体激动剂SERS 光谱分析

克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇都属于传统的瘦肉精[24]，这3 种β-受体激动剂在化学结构上具有一定的相似度， 在SERS 检测中也存在相似的信号特征峰， 在强度上各有不同。 由于苯环上取代基不同，3 种β-受体激动剂有不同的SERS 特征峰。克伦特罗特征峰有382、787、1 260、1 478、1 602 cm-1等波段，382cm-1处的峰由苯环耦合C-C-Cl 弯曲振动引起，787 cm-1处的峰由C-Cl 伸缩振动引起，1 260 cm-1处的峰由C-N 伸缩引起，1 478 cm-1处的峰由-CH3弯曲振动引起，1 602 cm-1处的峰由苯环上C=C 拉伸。莱克多巴胺的特征峰有831、1 170、1 265、1 502、1 592 等波段，831 cm-1处的峰由苯环中C-H 非平面弯曲振动引起。 沙丁胺醇特征峰有621、814、1 253、1 489、1 609 cm-1等波段，621 cm-1处的峰由脂肪族的扭动引起，1 253 cm-1处的峰由C-C3伸缩振动、C-N 伸缩振动以及O-H 弯曲振动引起。由特征峰数据对比可得，β-受体激动剂结合胶体金的拉曼光谱与固体标准品粉末光谱曲线相比， 拉曼位置存在偏移，这可能是由于某些化学键的水解所致。而胶体金在400～2 500 cm-1范围内无明显特征峰， 故不会影响目标物的检测。 β-受体激动剂吸附于胶体金表面形成“热点”，结合后产生表面增强现象。

拉曼光谱强度受胶体金与样品体积比和活性剂浓度的影响。 首先， 对胶体金与样品体积比进行优化，实验发现，3∶1 的体积比为最优条件，此时各波段的拉曼强度最大，增强效果呈现先增后减的情况，这是因为随着待测样品体积的增加， 金纳米颗粒会逐渐被稀释，不利于“热点”的形成。 另外，随着总体积的增大，散射光会被纳米球表面反射，穿透样品后造成一定程度的丢失，致使拉曼光谱强度降低。

NaCl 可以改变金纳米颗粒与待测物之间的电荷平衡，促进颗粒之间的聚集。 一定量的NaCl 溶液可以增强拉曼光谱信号，当浓度超过某一临界点时，高浓度的NaCl 溶液会使金纳米颗粒开始积聚沉淀，无法实现信号增强的效果。因此，金纳米、待测样品、NaCl 三者的体积比为3∶1∶1， 此时3 种β-受体激动剂的信号增强效果最好。

在最优条件下， 配置了浓度为1～105ng/mL 的样品标准溶液，均选用便携式光谱仪进行检测。克伦特罗不同浓度的拉曼光谱如图4 可见， 峰强随浓度降低而降低，以1 260 cm-1处特征峰峰面积（y）对应标准溶液浓度（x）绘制标准曲线，结果如图5，标准曲线为y=0.014 28+0.390 21lgx，R2=0.994 65。

图4 克伦特罗拉曼光谱图Fig.4 Kraent Rohmann spectrogram

图5 克伦特罗标准曲线Fig.5 Kraent standard curve

沙丁胺醇不同浓度的拉曼光谱如图6 可见，峰强随浓度降低而降低，以1 609 cm-1处特征峰峰面积（y）对应标准溶液浓度（x）绘制标准曲线，结果如图7 所示， 标准曲线为y=0.005 99+0.009 681lgx，R2=0.991 46。

图6 沙丁胺醇拉曼光谱图Fig.6 Salbutamol Raman spectra

图7 沙丁胺醇标准曲线Fig.7 Salbutamol standard curve

莱克多巴胺不同浓度的拉曼光谱如图8 可见，以831 cm-1处特征峰峰面积（y）对应标准溶液浓度（x）绘制标准曲线，结果如图9 所示，标准曲线为y=0.003 87+0.006 863 1lgx，R2=0.996 61。

图8 莱克多巴胺拉曼光谱图Fig.8 Ractopamine Raman spectra

图9 莱克多巴胺标准曲线Fig.9 Ractopamine standard curve

2.4 猪肉中β-受体激动剂定量分析

猪肉作为一类复杂的食品类别，含有的蛋白质、脂肪多种成分易对拉曼信号造成严重影响，导致目标物分子与金溶胶无法完全结合，将目标物拉曼特征峰信号减弱或者掩盖。 因此，样品前处理是很关键的一步。我们分别制备了3 种β-受体激动剂的不同浓度（2、4、6、8、10 μg/g）猪肉样品进行分析，经过方法优化，最终选用乙酸乙酯和10%碳酸钠溶液作为萃取剂，以金溶胶为增强底物，1% NaCl 溶液为聚集物，采集SERS 光谱，计算回收率。乙酸乙酯可以去除猪肉组织中多余的脂肪，在较短的时间里，去除杂质，并且其本身具有挥发性，与金溶胶混合后，迅速挥发。 选取乙酸乙酯作为提取剂，对整个实验结果不会造成影响和干扰。 以3 种β-受体激动剂在1 260 cm-1、1 609 cm-1、831 cm-1的峰进行定性定量， 计算各自的平均回收率，每个水平重复测量5 次。结果如表1 所示。 回收率均在80.3%～98.9%，RSD 在1.12%～3.26%，猪肉中克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇的检出限为1 ng/mL。

表1 3 种β-受体激动剂检出限、回收率和相对标准偏差（n=5）Table 1 Detection limits，recovery rates and relative standard deviations of three beta-agonists （n=5）

3 结论

本研究建立了一种基于表面增强拉曼光谱快速检测猪肉中3 种β-受体激动剂残留物的方法。该方法利用柠檬酸三钠还原氯金酸制备胶体金颗粒，结合快速前处理技术，操作步骤简单，分析速度快。在最优条件下，建立了3 种β-受体激动剂残留物特征峰拉曼强度与浓度（1～105ng/mL）的良好线性关系（R2值均在0.99 以上），开发了一种简便、灵敏的快速检测方法，可用于市场上精猪肉的快速筛查，对提升动物源性食品的风险监测能力发挥支撑作用。