β4GalT1-CD200R1 复合物在小胶质细胞炎性活化中的作用*

杨 杰，刘 超，段程伟

（1 南通大学附属南通第三医院/南通市第三人民医院神经外科，江苏 226006；2 苏州市吴江区第一人民医院检验科；3 南通大学第二附属医院/南通市第一人民医院临床医学研究中心）

小胶质细胞活化介导的炎症反应是中枢神经系统退行性疾病的共同特征[1]。β1,4-半乳糖基转移酶-1（beta 1,4-galactosyltransferase I,β4GalT1）是一种糖基转移酶[2],参与神经炎症的发生发展[3],在神经系统疾病中发挥重要作用。既往研究大多侧重β4GalT1 对细胞内信号转导的调控,尚不清楚该酶是否通过调节底物N-糖基化修饰而参与小胶质细胞活化。CD200R 是I 型跨膜糖蛋白,有CD200R1、CD200R2、CD200R3 和CD200R4 四种亚型,在中枢神经系统中CD200R1 主要表达于小胶质细胞,是CD200 的受体,CD200 主要表达于神经元表面[4]。CD200 与CD200R 结合能使小胶质细胞处于静息状态[5]。当CD200-CD200R 结合异常时,小胶质细胞活化增加,引起神经元损伤[6]。本研究分析β4GalT1 对CD200R1 N-糖基化的调节及其在小胶质细胞炎性活化和神经元损伤中的作用。

1 材料与方法

1.1 细胞模型 采用小鼠BV2 小胶质细胞株和人源胚胎肾细胞（HEK239T 细胞）（中国科学院上海细胞库）,加入DMEM 完全培养基（Thermo,11965092,含10%FBS、100 U/mL 青毒素、100 U/mL 链霉素）,置于5%CO2,37 ℃恒温培养箱培养,待细胞贴壁后进行相关实验。

1.2 原代皮层神经元培养 在生物安全柜内以75%酒精浸泡消毒,快速取出小鼠脑组织,以4 ℃预冷D-Hank 液冲洗,仔细剥离脑膜、血管。将脑组织置于D-Hank 液中剪碎,放入15 mL 离心管中,加入等量D-Hank 液和0.25%胰酶（Sigma,T4049）,置于37 ℃恒温培养箱内8 min,每隔3 min 摇晃1 次使消化完全。取出培养瓶,加入适量DMEM 完全培养基以终止消化。500 r/min 离心5 min,弃去上清液,加入适量DMEM 完全培养基,吸管反复吹打30 次使细胞呈悬浊状,静置5 min,留取上清液,400 目滤网过滤。将细胞悬液接种于培养瓶,细胞浓度5×105/cm3,置于5%CO2、37 ℃恒温培养箱中培养。4 h 后培养基更换为神经元培养液,3 d 后换全液,依细胞生长情况,每3～4 d 换半液。

1.3 β4GalT1 和CD200R1 表达载体的构建与鉴定 pcDNA3.1myc-β4GalT1 表达载体已由本实验室构建。CD200R1 表达载体构建:从相关网站（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/）获取小鼠CD200R1基因mRNA 序列,利用Premier 5.0 软件设计Flag-CD200R1 载体上下游引物,sense:5＇-CGGAATTCAATGTTTTGCTTTTGGAGA-3＇,antisense:5＇-GGGGTACCAGATTCCAATGGCCGAC-3＇,分别含有EcoRⅠ和KpnⅠ酶切位点。引物由上海铂尚生物科技有限公司合成。提取小鼠皮层制备RNA,进行逆转录反应获取cDNA,利用PCR 反应结合上述全长引物,扩增CD200R1 的全长cDNA,然后进行连接、转化和Sanger 法测序鉴定构建Flag-CD200R1 载体。随后根据Lipofectamine 2000 说明书,采用瞬时转染进行后续实验。

1.4 酶联免疫吸附法（ELISA） 运用ELISA 试剂盒（Abcam 公司）检测BV2 细胞中炎症因子iNOS、CD86、IL-1β、TNF-α 的表达,按试剂盒说明操作。将浓缩洗涤液稀释至工作浓度,标准品稀释至所需浓度,混匀后静置20 min。临用前将浓缩的生物素化抗体用稀释液按比例稀释,配制成抗体工作液。将标准品和样品加入ELISA 板条相应孔中,100 μL/孔。封板纸遮蔽孔位,37 ℃恒温箱中静置90 min,洗板3次。每孔滴加生物素化抗体工作液100 μL,封板纸遮蔽孔位,37 ℃恒温箱中静置60 min,洗板3 次。每孔滴加酶结合物工作液100 μL,用封板纸遮蔽孔位,37 ℃恒温箱中静置30 min,洗板3 次。每孔滴加显色液100 μL,37 ℃恒温箱中避光静置10～15 min。最后多功能酶标仪检测450 nm 处吸光值。空白孔不作任何处理。

1.5 Western Blot （1）配制胶板;（2）样品处理:蛋白样品于恒温金属浴中37 ℃解冻,13 000 g,4 ℃离心1 min,置于冰上;（3）上样:将样品加入上样孔,110 V 电泳70 min 左右;（4）转膜:采用PVDF 膜,恒流300 mA 转膜90 min;（5）封闭:5%脱脂牛奶室温封闭PVDF 膜2 h;（6）一抗孵育:按照相应稀释比用一抗稀释液稀释抗体,置于4 ℃冰箱孵育过夜;（7）二抗孵育:洗膜3 次,每次10 min。将膜置于稀释好的二抗中,室温孵育2 h;（8）显影:洗膜3 次,ECL 显影,采用图像分析软件进行分析。

1.6 免疫共沉淀 以中效RIPA 裂解液[含50 mmol/L Tris（pH 7.4）,150 mmol/L NaCl,1%NP-40,0.5%脱氧胆酸钠,0.1%SDS,1×protease inhibitor cocktail 和1×phosphatase inhibitor cocktail]裂解细胞,15 000 g,4 ℃离心20 min,吸取上清。取20 μL 上清液作为Input,其余上清液以磁性的protein A/G beads 预澄清后分为均等的3 份,分别加入对照IgG、抗myc 和Flag 抗体,4 ℃孵育轮转过夜。加入30～40 μL 磁性protein A/G 珠,继续4 ℃孵育轮转过夜。以中效RIPA 裂解液洗涤5 次,加入20 μL 1×SDS-PAGE 上样缓冲液,以Western Blot 法检测myc 和flag 相互结合情况。

1.7 统计学处理 应用SPSS 20.0 和Sigma Plot 10.0 统计学软件进行数据分析。计量资料以±s 表示,两组间比较采用t 检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 β4GalT1 与CD200R1 在HEK239T 细胞中存在相互作用 将myc-β4GalT1 和Flag-CD200R1 野生型全长质粒共转入HEK293T 细胞内,免疫共沉淀结合Western Blot 技术发现β4GalT1 与CD200R1 存在相互作用（图1）。

图1 β4GalT1 与CD200R1 在HEK239T 细胞中存在相互作用

2.2 β4GalT1 与CD200R1 在BV2 细胞中存在相互作用 将myc-β4GalT1 和flag-CD200R1 野生型全长质粒共转入BV2 细胞中,免疫共沉淀结合Western Blot 技术发现β4GalT1 和CD200R1 也存在相互作用（图2A）,细胞免疫荧光检测显示在正常组和LPS 处理组中,β4GalT1 和CD200R1 共定位于细胞膜（图2B）。

图2 β4GalT1 与CD200R1 在BV2 细胞中存在相互作用

2.3 β4GalT1 调节CD200R1 N-糖基化修饰 免疫共沉淀和凝集素（RCA-1）印迹技术检测结果表明,CD200R1 的N-糖链含有β-1,4-糖苷键（图3A,3B）。BV2 细胞转染myc-β4GalT1 或si-β4GalT1 后,显示β4GalT1 对CD200R1 的N-糖基化有调节作用（图3A,3B）。本实验显示44 号位突变后糖链表达减弱（图3C,3D）,表明CD200R1 存在着N-糖基化修饰,β4GalT1 参与CD200R1 的N-糖基化。

图3 β4GalT1 调节CD200R1 的N-糖基化修饰

2.4 N44Q 不改变CD200R1 的细胞定位 上述实验结果提示CD200R1 44 号位糖基化位点与CD200-CD200R1 的结合有关,为进一步研究该位点对CD200R1 的影响,我们在BV2 细胞中分别转染flag 标记的野生型CD200R1（wtCD200R1）和N44Q 24 h 后,使用免疫荧光显微镜检测外源性wtCD200R1和N44Q 的定位,显示野生型组和突变组中CD200R1 定位均未发生改变（图4）。

图4 44 号位突变前后CD200R1 细胞定位

2.5 N44Q 突变促进BV2 细胞炎性活化 在培养的BV2 细胞中加入CD200Fc 与CD200R1 结合,选择性转染myc-β4GalT1、wtCD200R1 和N44Q 突变体,LPS 处理后收集各组培养上清液,ELISA 检测显示,iNOS、CD86、IL-1β、TNF-α 炎性细胞因子的表达受到抑制,而转染N44Q 突变体则促进炎性细胞因子的表达（图5）。表明CD200Fc-CD200R1 抑制炎性细胞因子的释放,此过程有CD200R1 的N-糖基化44号位的参与,β4GalT1 对CD200R1 糖基化修饰抑制炎性因子的释放。

图5 在CD200-CD200R1 体系中N44Q 促进BV2 炎症活化

2.6 N44Q 突变促进神经元损伤 为进一步研究CD200R1 的N-糖基化修饰对BV2 细胞活化后释放神经毒性的影响,在BV2 细胞中转染myc-β4GalT1、wtCD200R1 及N44Q 突变体,LPS（100 ng/mL）刺激后加入神经元,采用LDH 试剂盒检测神经元损伤情况。在上述各野生型组和突变组BV2 细胞中加入神经元,结果显示加入anti-CD200 抗体后,野生型组神经元损伤增加。在突变组加入神经元共培养后,进一步加入anti-CD200 抗体后,神经元损伤无明显变化（图6）。

图6 N44Q 突变对神经元损伤的影响

3 讨论

当机体处于正常状态时,小胶质细胞维持静息状态,当处于疾病状态时,小胶质细胞被诱导活化,通过分泌IL-1β、TNF-α、TGF-β 等细胞因子促进小胶质细胞吞噬破碎细胞和变性髓鞘,对机体有益[8]。但当机体免疫状态异常时,小胶质细胞持续活化并分泌细胞因子和氧自由基,促使神经元损伤[9]。因此,小胶质细胞在中枢神经系统炎症中发挥双相作用。

β4GalT1 是研究最广泛的一种糖基转移酶,分为长型和短型两种,短型β4GalT1 与β-1,4-半乳糖苷键（Galβ1-4GlcNAc）的形成有关。本文研究短型β4GalT1,免疫共沉淀实验发现β4GalT1 和CD200R1存在相互作用,且参与调节CD200R1 的N-糖基化。CD200R1 广泛表达于包括小胶质细胞在内的髓系细胞表面,CD200 则广泛表达于神经元、内皮细胞、淋巴细胞等。研究表明,阻断CD200-CD200R1 结合能增强中枢神经系统中小胶质细胞的炎性活化和神经元损伤[6]。本课题组前期研究发现CD200R1 存在N 糖基化修饰,且44 号位糖基化扮演重要角色[7]。本文结果显示,CD200R1 的44号位点N-糖基化修饰对CD200-CD200R 的结合十分重要,去除该位点的N-糖基化将削弱CD200R1 与CD200 的结合。在LPS 诱导的小胶质细胞炎症活化模型中,发现使用抗CD200 抗体阻断CD200 与CD200R 结合,可上调炎症因子的表达,去除CD200R1 的44 号位点N-糖基化也呈现相似的效应,同时增强对神经元的损伤。本研究通过选择性调节小胶质细胞的过度活化,为中枢神经系统炎症性疾病提供潜在药物设计和治疗靶点。