基于“长期负性情绪积累肝失疏泄加速脑老化进程”假说的创新性研究*

侯俊林，周正，刘永，李宁，詹向红**

（1.河南中医药大学 郑州 450046；2.河南财经政法大学 郑州 450046；3.河南省中西医结合防治脑认知疾病工程技术研究中心 郑州 450046；4.郑州市中西医结合防治脑认知疾病重点实验室 郑州 450046）

脑老化过速的成因、机制、客观诊断指标及有效干预策略已成为衰老研究的关键科学问题。研究发现长期情志不畅是多种疾病的诱因[1]，但其对脑老化过速的影响及机制尚待阐明。中医药在脑老化疾病的防治中颇具优势，但既往研究多从脾肾入手，聚焦于既成的疾病，对主疏泄调畅情志的肝关注不够，对未病状态下肝藏象生理及个体差异鲜有论及，未见从肝论治脑老化过速疾病的策略和措施，缺乏诊断长期肝气郁结轻度认知功能障碍（Mild Cognitive Impairment，MCI）患者的客观指标。针对上述问题，詹向红课题组在多项国家级课题的支持下，加强了肝疏泄功能与脑老化关系的研究，提出“长期负性情绪积累肝失疏泄加速脑老化进程”假说，并围绕该假说开展了一系列创新性研究，下文予以总结，以期为从情志角度预防和治疗脑老化过速相关疾病提供参考。

1 优化长期负性情绪应激大鼠模型，创制愤怒情绪诱发影片

1.1 首创间接电击法构建大鼠长期愤怒情绪应激模型

愤怒是负性情绪的核心，长期愤怒情绪积累会对个体及社会造成严重危害[2]。长期愤怒应激动物模型的建立是动物情绪及人类情绪相关疾病研究的重点和难点之一。传统的直接电击法[3]存在躯体应激较多、不宜持续使用因而不利于诱发长期愤怒情绪等缺点，尚未得到业界一致认可。鉴此，课题组摈弃了对模型组大鼠的直接刺激，创立了一种新型的间接电击法：使用小动物电刺激器，首先把单只模型组大鼠放入打斗笼内，再随机放进一只攻击鼠，用电击激惹攻击鼠，使其对模型组大鼠发起攻击，导致模型组大鼠毛竖立、对峙、尖叫，甚至打斗、撕咬等[4]。按照Davidson等[5]对大鼠愤怒表情和行为的描述，模型组的表现符合愤怒应激状态特征。该方法把对模型组大鼠的躯体应激降到了最低，且具有愤怒情绪引出率高、程度适中、可持续时间长等优点，是目前研究长期愤怒情绪积累较为理想的模型。

1.2 改良慢性温和不可预知应激建立大鼠长期复合负性情绪应激模型

慢性温和不可预知应激（Chronic Unpredictable Mild Stress，CUMS）可模拟人类因经历多种身心刺激产生的复合性负性情绪，在动物情绪相关实验中被广泛应用。但传统CUMS中的直接电击、冰水游泳等易对动物产生躯体应激，所产生的心理应激不够纯粹。课题组通过反复实验，用间接电击代替直接电击，温水游泳代替冰水游泳，合理控制躯体应激成分，最终确立了适宜长期负性情绪应激动物建模的CUMS方法，为长期复合负性情绪应激的动物实验研究打下了良好基础[6]。

1.3 创制正常人群愤怒情绪诱发影片

以正常人为被试开展情绪研究，关键需激活所要研究的靶情绪。因影片通过视、听双通道输入刺激，可以使被试身临其境，因而是一种理想的情绪诱导方法。但目前国内外愤怒情绪影片均存在诱发情绪较为弥散，愤怒情绪优势不显著，分化和单一性欠佳等缺陷。因此课题组在参考国内外研究前沿的基础上，走访导演、制片人、摄像等多名国内电影界人士，并阅读电影评介，在河南电影制片厂对多部影片进行非线性编辑，历时8个多月，制作了4段愤怒情绪诱发影片和4段中性情绪诱发影片（对照）。以诱发强度、靶情绪击中率和靶情绪与非靶情绪的显著性差异为评定指标，经两次试验评定及优化处理，最终愤怒影片《罪恶与审判》和中性影片《渔舟唱晚》诱发的靶情绪强度较高，占主导地位，情绪优势突出，有较好的分化性和单一性，因此选定以上两段影片分别作为愤怒、中性情绪诱发影片（每段影片长度约13 min）[7]。上述情绪诱发影片解决了目标情绪激活质量这一决定愤怒情绪研究成败的关键问题，有利于愤怒情绪相关研究的开展。

2 多角度揭示负性情绪长期积累对脑老化进程的影响及其机制

2.1 动物实验研究

课题组研究发现无论单一负性情绪（愤怒）还是复合负性情绪长期积累均可使D-半乳糖（D-gal）脑老化大鼠发生如下变化：①Morris水迷宫寻台时间延长，学习记忆能力下降[8-9]；②大脑皮层和海马CA1区组织萎缩，神经细胞数量减少，海马神经元线粒体嵴变短、突触小泡数量减少、突触活性带缩短、突触后膜突触致密物质厚度变薄，海马糖皮质激素受体减少[10-12]；③血浆促肾上腺皮质激素（Adrenocorticotropic Hormone，ACTH）、皮质酮水平升高，5-羟色胺水平降低[8-11]。说明无论单一负性情绪（愤怒）还是复合负性情绪长期积累均可加重大鼠大脑皮层和海马的退行性病变、神经元突触可塑性障碍，加速大鼠脑老化进程。其机制可能与下丘脑-垂体-肾上腺轴持续激活、单胺类神经递质紊乱和海马应激性损伤有关。此外，复合负性情绪长期积累还可导致大鼠海马神经元内谷氨酸含量、钙离子（Ca2+）浓度、N-甲基-D-天门冬氨酸（N-methyl-D-aspartate，NMDA）受体含量增高，钙调蛋白（Calmodulin，CaM）和磷酸化环腺苷酸反应元件结合蛋白含量下降[13]；导致D-gal脑老化大鼠海马神经元NMDA受体-2B亚型基因启动子区CpG甲基化程度及DNA甲基化转移酶1活性增高[9]；提示复合负性情绪长期积累加速大鼠脑老化进程的机制还可能与海马Ca2+/CaM-钙调蛋白激酶（CaMK）Ⅱ-环腺苷酸反应元件结合蛋白信号通路及NMDA受体-2B亚型基因甲基化有关。上述结果为课题组的假说提供了实验证据。

2.2 病例对照研究

以阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）患者为病例组，以同性别、同年龄段、同等教育程度1∶1匹配正常被试为对照组开展研究。结果 显示，AD患者特质怒量表得分更高，高特质怒者更多，高特质怒人群发生AD的概率更大[14]。提示愤怒情志与AD发病相关，长期愤怒情绪积累是AD发病的危险因素。

由于AD患者的认知功能衰退不可逆，而MCI是介于正常衰老和痴呆的中间状态，是认知过速衰退早期干预的最合适群体，已成为近年脑老化研究领域的焦点。因此课题组以MCI患者为病例组，按照同性别、同年龄组、同文化教育程度1∶1匹配正常被试为对照组开展研究。结果 显示，MCI患者正负性情绪量表（扩展版）中的负性情绪量表得分更高（t=-3.077，P=0.003），高负性情绪特质者更多（χ2=10.694，P=0.001），OR=5.364，95% CI为（1.774，16.225），高负性情绪特质人群发生MCI的概率更大，提示负性情绪与MCI发病相关，长期负性情绪积累是MCI发病的危险因素。上述结果为课题组的假说提供了流行病学证据，提示应重视调畅情志在AD和MCI防治中的作用。

2.3 正常人群研究

探讨愤怒情志对工作记忆容量影响及高、低特质怒被试神经电生理差异的研究对被试年龄无特殊要求，只要是成年人即可。因此课题组以平均年龄21岁的在校正常大学生为对象，采用国际通用的状态-特质愤怒表达量表2筛选高、低特质怒被试。发现观看愤怒情绪诱发影片后高特质怒被试的数字回忆正确率低，提示高愤怒唤醒状态者的数字工作记忆容量更易受损[15]。以Go/Nogo范式采集并比较高、低特质怒被试平静状态下的事件相关电位（Event-Related Potentials，ERPs），发现低特质怒被试顺利诱发出了Nogo效应，而高特质怒被试Go条件下产生的P3波增大，因而其差异波较小，Nogo效应不明显[16]。提示易怒者的认知加工激活程度较高，即使在处理正常刺激信息时也投入了较多的认知资源，致使其能够动员的抑制控制能力不足。

以40-65岁已进入衰老及脑老化阶段且基础疾病较少的正常人群为对象，采用艾森克人格问卷（Eysenck Personality Questionnai，EPQ）中的N量表筛选情绪稳定、不稳定型被试。发现情绪不稳定被试有如下改变：①血浆去甲肾上腺素含量升高[17]；②ERPs进行中任务及前瞻性任务的N1波幅均更大[17]；③尿8-羟基脱氧鸟苷（8-hydroxydeoxyguanosine，8-OHdG）含量及血浆过氧化脂质含量升高，端粒长度缩短、端粒酶活性降低[17]；④反应速度及反映认知功能年老化的流体智力水平均有所下降[17]。提示情绪不稳定型的中老年人易处于情绪应激状态，占用更多的早期注意资源，对无关信息的干扰抑制能力降低，影响了对认知资源的合理分配，衰老及脑老化更加明显。

以上正常人群研究突破了动物实验和临床研究的局限，获取了若负性情绪长期积累加速脑老化进程可能的直接生理证据。

3 提出“肝藏象具有个体差异”，发现中医肝藏象个体差异的部分遗传背景和神经电生理证据

3.1 提出“肝藏象具有个体差异”

“肝主疏泄，调畅情志，在志为怒”是中医学的重要命题。课题组发现个体愤怒情志的启动、表达和控制存在较为稳定一致的倾向性，这种倾向可在一定程度上反映“肝藏”功能倾向的个体差异[18]。因此，课题组提出“肝藏象具有个体差异”的观点，并进行了如下实验研究，发现了其遗传背景和神经电生理基础。

3.2 发现中医肝藏象个体差异具有遗传背景

课题组以正常大学生为研究对象，对愤怒特质与神经递质代谢酶基因多态性的关系展开研究。发现高特质怒者下列愤怒特质与色氨酸羟化酶（Tryptophan hydroxylase，TPH）基因A218C多态性有关：发怒特质，女性怒的表达特质，男性郁怒特质及控制发怒特质；低特质怒者下列愤怒特质也与该位点多态性有关：郁怒特质，怒的控制特质，控制发怒特质，控制郁怒特质及女性控制发怒特质。此外低特质怒女性的控制发怒特质还与单胺氧化酶A（Monoamine oxidase A，MAOA）基因tag SNP rs2235186多态性有关[18]。以上结果表明中医肝藏象个体差异确有遗传背景。

3.3 发现中医肝藏象个体差异具有神经电生理基础

采用ERPs技术，以Go/Nogo范式采集并分析正常人群中不同愤怒特质者的脑电。①对愤怒启动特质的研究显示：高特质怒者完成Go任务时的反应时短，错报率高，P3波幅大；低特质怒者诱发出了Nogo效应，而高特质怒者Nogo效应不明显，提示肝失疏泄易怒倾向者认知加工激活程度较高，而抑制控制能力较低[16]。②对愤怒表达特质的研究显示：肝疏泄不及郁怒倾向者Nogo-N2波幅较肝疏泄太过发怒倾向者小，提示肝气郁倾向者较肝气逆倾向者冲突监控能力弱[19]。说明中医肝藏象个体差异确有相应的神经电生理基础。

上述研究拓展了肝藏象的内涵，深化了对于肝藏象生理功能个体差异的认识，有利于肝失疏泄脑老化过速等相关疾病的早期预警和个体化预防。

4 发现MCI可能的早期客观诊断指标

以长期肝气郁结MCI患者为对象，把高时间分辨率的ERPs和高空间分辨率的功能磁共振成像（Functional Magnetic Resonance Imaging，fMRI）等技术结合，探讨患者的神经电生理及影像学特征。①ERPs实验的Oddball范式中MCI患者P3a潜伏期延长[20]；Nback范式中MCI患者的正确率降低，N200、N400波幅增大，P300潜伏期缩短（P3b的诱发失败）、波幅减小[21]。提示肝气郁结MCI患者注意朝向困难，工作记忆信息编码和储存能力及语义加工能力下降。②fMRI结果显示，MCI患者左侧枕中回和岛盖部额下回低频振幅（Amplitude of Low Frequency Fluctuation，ALFF）值降低，提示患者上述脑区兴奋性下降[22]。MCI患者左海马与右舌回、右距状裂周围皮层之间的功能连接（Functional connectivity，FC）下降，提示大脑“执行控制网络”抑制干扰信息的功能受损[23]。MCI患者左侧额下回、左侧额中回和左侧中央前回的局部一致性（Regional Homogeneity，ReHo）减弱，提示上述脑区神经元自发活动的同步性降低[24]。由此可见，ERPs和fMRI的ALFF、FC和ReHo分析可较为灵敏地区分长期肝气郁结的MCI患者和正常被试，为脑认知疾病的早期筛查和诊断提供了可能的客观检测指标。

5 探明疏肝法可改善MCI患者的认知功能及其机制

依据所提出并初步验证的“长期负性情绪积累肝失疏泄加速脑老化进程”假说，自2012年开始课题组应用蒙特利尔认知评估量表（Montreal Cognitive Assessment，MoCA）、肝气郁结证症状程度计分表、艾森克人格问卷（Eysenck Personality Questionnai，EPQ）、正负性情绪量表（扩展板）等在河南省内多个地级市开展流行病学调查，并利用fMRI、磁共振波谱（Magnetic Resonance Spectrum，MRS）及ERPs等技术发现的脑老化早期客观诊断指标为1120人进行了检测，对筛查出的115名肝气郁结MCI患者行疏肝法干预，取“知肝传脾，当先实脾”既病防变之意，服用疏肝解郁名方逍遥丸3个月。结果 显示：患者肝气郁结评分下降、认知功能提高，神经内分泌、氧化应激、fMRI、MRS及ERPs相关指标得到改善，临床疗效显著。具体如下：①神经心理学评估结果显示，患者用药后的抑郁及肝气郁结程度均降低，MoCA量表及中国修订韦氏成人智力量表四合一简式总分均升高[25-26]。②衰老生物学和神经内分泌指标显示，患者用药后外周血单个核细胞端粒酶活性升高，尿8-OHdG含量及血浆ACTH水平降低[25-27]。③ERPs Oddball实验结果显示，患者用药后P3a潜伏期缩短[28]；N-back实验发现，患者用药后P300潜伏期整体延长（诱发了P3b），N200潜伏期缩短，N400波幅和潜伏期均减小[21]。④fMRI和MRS检测发现，患者用药后右侧枕中回ALFF值降低，左侧颞上回和左侧颞中回ALFF值增高，右后扣带回胆碱/肌酸（Ch/Cr）比值降低[22,29]。表明疏肝法能够改善长期肝气郁结MCI患者的抑郁情绪、肝气郁结症状和认知功能，其疗效机制可能与恢复HPA轴功能状态和减轻组织氧化损伤，增强注意力朝向、工作记忆刺激识别、信息编码储存及语义加工能力，减轻右后扣带回神经元损伤、提升“执行控制网络”抑制干扰信息的功能及左侧颞上回和颞中回的兴奋性有关。上述结果反证了课题组假说的正确性，在传统的补肾健脾、活血化瘀之外为认知老化过速相关疾病的防治提供了以疏肝为主的新方案。

6 小结

综上所述，课题组围绕“长期负性情绪积累肝失疏泄加速脑老化进程”假说开展研究，历经10余载，“病因”从单一情绪扩展到复合情绪；“对象”从严重的阿尔茨海默症到轻度认知功能障碍再到正常人群，研究重心前移，体现了防治结合、未病先防的研究理念；“方法”从动物实验、正常人群、病例对照到临床干预研究，多层面全方位证实了上述假说，并从神经内分泌、钙/钙调蛋白通路、表观遗传学等方面论证其分子机制。其后，进一步挖掘中医肝藏象的科学内涵，深化了对肝藏象生理功能个体差异的认识，推动了肝失疏泄脑老化过速等相关疾病的早期预警和个体化预防。此外，借助ERPs和fMRI等现代科学技术，找到了认知功能损伤的早期敏感成分，为疾病筛查和临床诊断提供了生物学证据，弥补了既往依靠量表诊断的主观缺陷。同时，疏肝法防治认知老化过速相关疾病取得确切疗效，拓展了传统经典方药的适用范围。而正常人群的生理研究则改变了动物实验和临床研究结果难以直接推论到正常人体的局面，是中医藏象研究方法的突破。该系列研究为神经退行性疾病的预警提供了病因学、分子遗传学、神经生理学及影像学依据，为情志相关脑老化过速疾病提供了从肝论治的新方案。

该系列研究也存在一定的局限性。如课题组发现我国正常大学生某些愤怒特质与神经递质代谢酶基因多态性有关，但不同的种族或地域可影响基因多态性的分布，在研究开展时课题组尚未能完全排除上述因素的影响，这可作为今后努力的方向，以使结果更具普适性。